胶体金快速免疫诊断技术.ppt

1、免疫色谱高速诊断技术，色谱技术优势：简单现场迅速，1 .打开包装取出试纸，2 .直接插入被测试样品，3 .目视读取结果(3-10分钟以内)，与通常的诊断方法相比，技术应用，玻璃纤维膜(金胶体垫)。 胶片上吸附着干燥的金标抗体(流动带)。 硝酸纤维素膜、膜上复盖着能与抗原或抗体带和标记物直接反应的质量控制带(检查带)。 吸水纸。 以上各组的首尾相互连接着。 将已知的特异性抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上的某个区作为检测带，在样品区滴加样品后，通过毛细作用使样品移动到玻璃纤维膜，金标复合体溶解，与样品进行抗原抗体反应形成复合体，接着移动到硝酸纤维素膜的检测区。 如果样品中没有应该测定的抗原和抗体，就

2、不发生结合，即不发色。 在硝酸纤维蛋白膜检查区附近，将与金标记结合物相对应的抗原或抗体作为质量控制带进行再固定，无论样品中有无测定对象物，都会显示质量控制线，如果没有则检查失败。 整个过程通常在15分钟内完成，操作简单快捷，不需要设备。 免疫色谱检测原理分类介绍，金胶体免疫色谱检测流脑抗体(间接法)金胶体标记兔抗人IgG，样品中流脑抗体与金胶体标记抗人IgG结合，沿硝酸纤维素膜移动，与流脑抗原结合，出现红色反应线。 免疫色谱检查原理分类介绍(双抗体夹层)、(以HCG检查为例)，HCG-亚基抗体Y2、羊抗小鼠二抗固定在硝酸纤维素膜上，金标准HCG-亚基单抗Y1固定在玻璃纤维素膜上。 免疫色谱检测

3、原理分类介绍(竞争反应)、(以吗啡检测为例)，吗啡偶联和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。 吗啡偶联与尿液中吗啡竞争结合金标准单克隆抗体，最小检测量为300ng/ml。 结果判定：阳性():吗啡300ng/ml以上，质控区出现紫红色带，试验区内未出现紫红色带。 吗啡浓度高于300ng/ml时，胶体金抗体与吗啡全部结合，不与吗啡偶联，未出现紫红色带。 阴性(-) :吗啡在300ng/ml以下。 出现两条紫红色带，一条在测试区内，另一条在质量控制区内。 吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡全部结合。 这样，胶体金抗体在色谱过程中与固定在膜上的吗啡偶联反应，在试验区内出现

4、紫红色带。 无效：品质管理区未出现紫红色带，表示操作过程不当或试剂盒变质破损。抗体Antibody、来源差3360鼠抗、兔抗和羊抗种类差：单抗、多抗浓度：浓缩溶液：不含盐，抗原抗体生物原料、抗原Antigen、全病毒抗原重组抗原、胶体金是盐酸(HAuCl4)的胶体金的一些物理根据粒子的大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，胶体金广泛应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 容器硅化处理：玻璃表面的少量污染妨碍了金胶体颗粒的生成，所有玻璃容器都必须绝对清洁，预酸洗、硅化。 将玻璃容器浸渍在二氯二甲基硅烷的氯仿溶液中分开，室温干燥后用蒸馏水洗涤，干燥准备。、金胶体的制备、金胶

5、体的制备、柠檬酸三钠还原法15nm、18nm30nm、40nm或50nm金胶体粒子的制备：采集0.01HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。 根据需要迅速加入柠檬酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，持续煮沸约5min，出现橙红色。 这样制作的金胶体粒子分别为15nm、1820nm、41nm、50nm的颜色和粒子的关系即1柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00金溶胶色蓝灰紫灰紫红橙吸收峰(nm ) 220240 53 同时，良好的胶体金应该清澈透明，暗示有浑浊或浮游物的话凝聚粒子多。 2 .扫描分光光度修正吸收峰值时的光波长，估算金粒子的大

6、小。 3 .用电子显微镜正确测量了金粒子的大小。 免疫金胶体的制备金胶体在弱碱环境下带负电荷，可以与蛋白质分子的正电荷基形成牢固的结合，因此该结合是静电结合，不影响蛋白质的生物特性。 蛋白质预处理：1 .蛋白质首先透析低离子强度的水，除去盐类成分。 盐类成分影响胶体金对蛋白质的吸附，使胶体金沉淀，应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在。 2 .微细孔过滤器或超速离心除去蛋白质溶液中的微粒子。 3 .胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值，在蛋白质等电点稍微接近偏碱的条件下，两者容易形成牢固的结合物。 如果胶体金的pH低于蛋白质的等电点，则聚集而失去结合能力。 蛋白质最适量测定：将应标记的蛋白质(小鼠

7、抗人IgG )储藏液系列稀释后，分别取0.1ml加入1ml金胶体溶液中，设置不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1 ml 10 NaCl溶液如果添加nacce的蛋白质的质量达到稳定量以上，则胶体金保持红色，不稳定的金溶胶沉降，形成对照管和蛋白质的添加量不足以使金胶体稳定的各管，呈现从红变为蓝的沉降现象的蛋白质的添加量在最低稳定量以上的各管仍然为红色。 1ml胶体金溶液稳定的红色不变的最低蛋白质使用量，即该标记蛋白质的最低使用量，在实际操作中，蛋白质分子在金粒子表面的吸附量最大的10可以适当增加。 胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂以避免凝聚。 使用PEG (分子量20000 )和牛血清白蛋白作为

8、稳定剂。 添加量：5BSA溶液终浓度为1%； 在全溶液的1/10中加入1%的聚乙二醇。 以0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl将金溶胶调整到所希望的pH。 向100ml金溶胶中加入标记量最佳的蛋白质溶液，搅拌23分钟。 加入1%peg20000溶液5ml。 10000100000g用离心3060分钟仔细吸取上清液(避免跌倒)。 将沉淀悬浮在含有一定体积的0.20.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，用相同的缓冲液恢复，浓度A540nm=1.5左右即可，用防腐装置4保存。 被复的金溶胶浓缩后，也可以用Sephadex G-200柱进行凝胶色谱分离纯化，用含有0

9、.1%BSA的缓冲溶液洗脱。 通常被IgG包复的金溶胶洗脱液的pH为8.2。 在以上的操作中，可以高速离心或微孔过滤器进行预处理，注意所有的溶液中都不含有杂质微粒子。 胶体金蛋白结合物质量鉴定平均直径的测定：支撑膜镍网(也可铜网)上涂金标准蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。 或者用醋酸铀再染色观察。 修正100个金粒子的平均直径。OD520nm值测定：用PBS液(含1 % BSA )稀释胶体金蛋白试剂1:20，OD5200.25左右。 一般应用液的OD520定为0.20.4。 金标记蛋白的特异性和敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法。 将可溶性抗原(或抗体)吸附在载体(滤纸、硝酸纤维

10、膜、微孔过滤器)上，利用直接或间接染色法对用胶体金标记的抗体(或抗原)进行银显影，检测相应的抗原或抗体，鉴定金标记蛋白质的特异性和敏感性。 胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜的制备，将胶体金标记的小鼠抗人IgG放入玻璃纤维素膜中浸渍10分钟，取出到37度烘箱中烘干，热熔封口，放置4度冰箱准备。 (实验阶段)用喷雾点仪将用胶体金标记的小鼠抗人IgG喷到玻璃纤维素膜上，真空干燥2小时。 (生产阶段)、NC膜、NC膜的选择上升速度(？ 什么？ 什么？ 秒/4cm )当对灵敏度的影响通过相同的t线喷射点位置时，金属溶液通过的速度是快的膜慢膜，通过速度越快，t线中包含的物质的反应时间也越短，读取值越快，灵敏度

11、也越低。 相反，反应时间越长，读取值越慢灵敏度也越高。 同时另一个问题是，反应时间越长，发生非特异性键的可能性越大，所以长时间的反应未必能真正提高灵敏度。 不同膜厂家的产品(Whatman、Millipore、Sartorius )大致为： 135s和180s，抗原、抗体包复固相NC膜的制备、包复流脑抗原浓度即包复抗小鼠is 、溶液喷雾点(喷雾点演示：BIODOT XYZ系列喷雾点设备)、CT管线溶液预处理： 1.过滤、0.22um孔径过滤器2 .离心1万转10分钟的CT管线喷雾点工艺和接触喷雾点工艺干燥、干燥方法比较37度干燥h :粒状感强，中间白，周边深的低温真空干燥h :颜色均匀，两端稍浅，具有一定的柔软性。 组装试验纸，在干燥期间准备吸水滤纸、样品垫、PVC基板，在PVC基板的中央粘贴硝基纤维素薄膜，在硝基纤维素薄膜上缘粘贴吸水滤纸，在硝基纤维素薄膜下缘粘贴金垫，在金垫下缘粘贴样品垫，完成后切割将试纸密封在铝箔袋中，完成产品组装。 切片包装、切片(演示：BIODOT CM4000切片机)包装、质量管理、1特异性均经30份阴性参考血清检查，结果不得出现假阳性