微生物基本操作规范.ppt

1、食品微生物检验规范操作基础培训 1 清洗、消毒和灭菌操作福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室2010.05,主要内容：, 1清洗、消毒和灭菌操作 2培养基的制备 3采样和取、制样 4接种、分离纯化 5制片、染色及显微观察 6实验室安全基础知识, 1 清洗、消毒和灭菌操作,1.1 玻璃器皿的清洗 1.1.1新购的玻璃器皿 碱性玻璃浸泡于mol/L盐酸浸泡过夜，中和玻璃中的碱性物质。 1.1.2用过的玻璃器皿 污染的器皿，必须经过适当消毒， 污迹不能洗净时，可浸泡于洗液内。 1.1.3洗液的配制 称取重铬酸钾100g与1000mL水置大烧瓶中加热搅拌溶化，待冷却后，将烧瓶置冷水中，慢慢加

2、入浓流酸250mL，并不断搅拌。,1.2消毒、灭菌,消毒（disinfection）：杀灭物体上病原微生物的方法，但不一定杀死细菌芽胞。 灭菌（sterilization）：杀灭物体上包括芽胞在内的所有病原性和非病原性微生物的方法。 防腐（antisepsis）：防止或抑制细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。 无菌（asepsis）：不含活菌的意思。防止微生物进入机体或物体的操作方法，称为无菌操作或无菌技术。进行微生物实验、外科手术及医疗技术操作等过程，均需进行严格的无菌操作。,消毒灭菌的方法,（一）物理消毒灭菌法 （二）化学消毒法,（一）物理消毒灭菌法,1.热力灭菌法 热力灭菌法分干热灭菌和

3、湿热灭菌两大类。在同一温度下， 后者效力比前者为大，这是因为： （1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固； （2）湿热的穿透力比干热大； （3）湿热的蒸汽有潜热存在。水由气态变为液态时释放出的潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。,加热灭菌和加热消毒的方法,干热灭菌法 火焰灭菌法 干燥加热空气灭菌法 高温灭菌 巴氏消毒法 常压下 煮沸消毒法 湿热灭菌法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加压下 (高压蒸汽灭菌法) 连续加压灭菌法,干热灭菌法,1.焚烧：是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废弃物品或尸体等。 2.烧灼：直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。 3.干烤：鼓风干燥箱灭菌。一般加热至

4、160170经2小时。适用于高温下不变质、不蒸发的物品， 如玻璃器皿、瓷器等。,湿热灭菌法,1.煮沸法：1个大气压下，煮沸的水温为100，一般细菌繁殖体煮沸510分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸1小时，才被杀死。水中加入2%碳酸钠，可提高沸点达105，促进细菌芽胞的杀灭。 2.巴氏消毒法（pasteurization）:用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热61.162.8半小时即可，常用于牛奶和酒类等的消毒。,3. 间歇灭菌法（郭霍氏蒸汽消毒）:将待灭菌的物品100加热1530分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体

5、，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。针对有点培养基和牛奶、糖等在100以上有效成分易被破坏的产品进行灭菌。 4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽灭菌器内进行的。通常采用纯饱和蒸汽压为103.4kPa，温度达121,维持1530分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。 适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服、耐高温塑料用品等物品的灭菌。,在高压蒸汽灭菌前要确保高压锅中的所有冷空气已经排空，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。 定期对灭菌效果进行监测和验

6、证，可采用： 物理监测法（留点温度计法、热电偶法）； 化学指示剂法（化学指示胶带、指示卡等）； 生物指示法（孢子悬液、孢子条带等）监控高压灭菌 的效果。,2.辐射,利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广 。 1.紫外线：紫外线波长为200300nm时具有杀菌作用，其中以260nm最强。紫外线杀菌机理主要是作用于细菌DNA，使同一条DNA 链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变DNA的分子构型，干扰细菌DNA的复制与转录，导致细菌的死亡或变异。紫外线穿透力差，故只适用于空气及不耐热物品的表面消毒。 2.应用射线作食品表面杀菌，射线用于食品内

7、部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。,3.滤过除菌,采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。 滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素、药液、空气等除菌。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。 滤菌器的种类很多，目前常用的有蔡氏滤菌器、玻璃滤器、薄膜滤器。,（二）化学消毒法,化学药物

8、根据其抑菌或杀死微生物的效应分为杀菌剂、消毒剂、防腐剂三类。 1.凡杀死一切微生物及其孢子的药剂称杀菌剂； 2.只杀死感染性病原微生物的药剂称消毒剂； 3. 只能抑制微生物生长和繁殖的药剂称为防腐剂。 但三者界限往往难以区分。化学药剂的效应与药剂浓度、处理时间长短和菌的敏感性均有关系，主要仍取决于药剂浓度。大多数杀菌剂在低浓度下只起抑菌作用或消毒作用。它们的杀菌或抑菌原理基本相同。实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂列于下表 。,实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂,接种室、培养室空气熏蒸消毒,甲醛熏蒸消毒法 （1）加热熏蒸 按熏蒸空间计算，量取甲醛溶液，盛在小烧杯或白瓷坩埚内，用铁架支好，点燃酒精灯

9、，关闭室门。甲醛溶液煮沸挥发，酒精灯最好能在甲醛蒸完后即自行熄灭。所需酒精的量要加以控制。 （2）氧化熏蒸 称取高锰酸钾（相当于甲醛用量的1/2）于一白瓷坩埚或玻璃烧杯内，再量取定量的甲醛溶液，准备妥当后，把甲醛溶液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种强氧化剂，当它与一部分甲醛溶液作用时，由氧化作用产生的热可使其余的甲醛溶液挥发为气体。甲醛溶液熏蒸后关门密闭保持12h以上。 硫磺熏蒸法 称好硫磺粉，将其放在垫有几张废纸或火柴棍的白瓷坩埚或烧杯内，点火燃烧，密闭24h，硫磺燃烧前在室内墙壁、桌面、地上喷洒些水，使之产生的H2SO3杀菌力增强。为了防止H2SO3和

10、H2SO4对金属腐蚀，熏蒸前将金属制品妥善处理。,影响消毒灭菌效果的因素,1.消毒剂的性质、浓度和作用时间：一般情况下浓度越大，作用时间越长，杀菌效果越好。但95%的乙醇消毒效果反不如75%为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀菌作用。 2.微生物的种类与数量：同种消毒剂对不同微生物的杀菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力 比其他的菌强；70%乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。 3.环境中有机物的影响：消毒环境中如有有机物存在，如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀菌效果。,2培养基的制

11、备,培养基是指以液体、半固体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。,2.1 培养基的分类,2.1.1根据培养基的组成来源不同来区分: 天然培养基; 合成培养基; 半合成培养基。,天然培养基,天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料。如：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等 优点：营养成分丰富，培养效果好，来源广泛. 缺点：成分难以确切知道。,合成培养基,合成培养基是一类化学成分和数量

12、完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。 这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。,半合成培养基,在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。 这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。,固体培养基； 液体培养基； 半固体培养基。,2.1.2根据培养基的物理状态来区分,液体培养基,所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。,固体培养基

13、,在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。,半固体培养基,把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。 这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,运输培养基； 保存培养基； 增菌培养基。,2.1.3根据培养基的用途来区分,运输培养基,在取样后和实验室样品处理前的时间，保护和维持微生物活性的培养基（如Stuart或Amies运输培养基）。运输培养基中通常不允许包含

14、使微生物增殖的物质，但是培养基应能保护菌株，确保它们不变质。,保存培养基,用于在一定期限内保护和维持微生物活力，以防对微生物在长期保存中产生不利影响，或使微生物在长期保存后容易复苏的培养基（如Dorset卵黄培养基）。,复苏培养基,能够使受损或应激的微生物修复，使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基。,增菌培养基,大多为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供较适当的生长环境，包括： A.选择性增菌培养基：能够保证特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他菌体生长的培养基（如SC、LST、RV等）； B.非选择性增菌培养基：能够保证大多数微生物生长的培养基（如M肉汤、营养肉汤）。

15、,分离培养基,支持微生物生长的固体或半固体培养基，包括： A.选择性分离培养基：支持特定微生物的生长而抑制其他微生物生长的培养基（如PALCAM琼脂、TCBS、显色培养基等）； B.非选择性分离培养基：对微生物没有选择性抑制的分离培养基（如脑心浸液肉汤、营养琼脂）。,鉴别培养基,能够进行一项或多项微生物生理学和生化特性鉴定试验的培养基（如尿素培养基、Kligler琼脂等）；能够用于分离培养的鉴别培养基被称作分离/鉴别培养基（如XLD、DHL、TCBS等）。,鉴定培养基,能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认实验的培养基（如ONPG、氧化酶试剂）。用于分离的鉴定培养基被称为分离/鉴定培养

16、基（如显色培养基）。 显色培养基是在选择性培养基上加入了适量的带发色及荧光基团的酶底物，发色团（荧光团）与特殊酶可识别的基团相连。目标微生物产生一些特殊的可水解发色及荧光底物的酶，使得发色和荧光基团释放出来，从而使目标微生物带上易于辨别的特殊颜色或发出荧光。,多用途培养基,同时具有多种不同用途的特定培养基。例如，血琼脂是一种复苏培养基，又是分离培养基，还可作为溶血实验的鉴别培养基。,(1)即用型培养基：以即用形式置于容器中（如平皿、试管或其他容器）供应的培养基。 (2)商品化脱水合成培养基：不立即使用的干粉形式的（如粉末、小颗粒、冻干等形式）培养基。溶于水后能制备成一种或两种类型的培养基： a

17、)完全即用型培养基：不需要添加其他成分的培养基； b)不完全即用型培养基：使用时加入不稳定成分。,2.1.4 根据培养基的制备方法不同来区分,2.1.5 实验室制备个别成分培养基,实验室按照培养基配方逐一称取个别成分，按照培养基制备程序进行。,2.2培养基的制备,正确制备培养基是微生物检验的一个基本步骤。在处理脱水培养基和其他含有有害物质（如胆盐或其他选择剂）的培养基时，应遵守良好实验室规范（GLP）和生产厂商的注意事项。 使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如质量（体积）、pH、制备条件、灭菌条件、操作步骤等。 当使用独立成分制备培养基时，按配方准确配制并

18、记录所有配制步骤。另外，记录所有使用成分的特性（如代号和批号等）。,（1）水,配制培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，目的是排除抑制或影响微生物生长的物质。为保证蒸馏水的质量，蒸馏水的电阻率最少应达到0.3M/cm。建议不使用未经过微生物含量检测的水（细菌总数应小于1000CFU/mL）。,（2）称量和复水,称量所需的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风橱中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。,（3）溶解和分装,脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热前应先浸泡

19、几分钟。由个别成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。,（4）pH的测定和调整,用pH计测pH，必要时进行调整。在实验室用个别成分制备的培养基，除特殊说明外，培养基灭菌并冷却到25时，培养基的pH变化不应超过0.2个pH单位。一般使用大约浓度为40g/L（约1mol/L）氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L(约1mol/L)的盐酸溶液进行培养基pH的调整。 值得注意的是，商品化的培养基在高压灭菌前后的pH可能变化很大，但使用质量好的蒸馏水或去离子水配制时，灭菌前并不需要调节pH。,（4）分装,将配制好的培养基分装到适当的容器中，应按使用的目的和要求，分

20、装于试管、烧瓶等适当容器内，分装量不得超过容器装盛量的2/3。 容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。,分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。 此外还须用防水纸包扎（目前试管一般多有用螺旋盖，采用金属或塑料试管帽），分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能 形成2/3底层和1/3斜面的量为恰当。 每批培养基应另外分装20mL培养基 于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时 灭菌，作为测定该批培养基最终p

21、H之用。,培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。但有些特殊培养基（如嗜盐琼脂培养基、MKTTn、科玛嘉弧菌显色培养基等）只能煮沸灭菌。煮沸后应迅速冷却，避光保存；明胶、血清、糖类等不耐高温的物质，应采取高压锅低温灭菌法（间歇灭菌法）灭菌；有些试剂不需灭菌，可以直接使用（参见相关国际标准或供应商使用说明）。 所有培养基湿热或过滤灭菌后,必须进行监测,尤其是要对pH、颜色、无菌效果和均匀性等指标进行监测。,（6）灭菌,制备含有有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时，需要特别小心（必要时在通风橱内操作），避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。 制备溶液时要特别小心并按产品使用说明

22、操作，不要使用过期的试剂。 对于抗生素工作溶液，应当现用现配。在特定环境下，抗生素溶液应适量分装后冷冻储存，但解冻后的溶液不能再次冷冻，生产厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。,（7）添加成分的制备,2.3培养基的使用,(1)琼脂培养基的融化 将培养基放到沸水浴中或使用有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）使之融化。经过高压的培养基尽量减少加热时间以保证培养基的质量。避免过度加热，培养基融化后即可将其从加热器上取下，放入472的恒温水浴锅中冷却，直至使用。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。,(2)培养基的脱气 必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽

23、浴中加热15min，加热时松开容器的盖子；加热后盖紧盖子，迅速冷却至使用的温度。 (3)添加成分的加入 对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至472时再加入。在加入灭菌的添加成分前，先放置到室温，避免冷的液态造成琼脂凝结或形成片状物。将加入培养基的所有添加物缓慢充分混匀，然后尽快分装到要使用的容器中。,(4)培养基斜面和平板培养基的制备和储存 琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。 制备平板培养基，将融化的培养基倾注到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼

24、脂层（对于直径90mm的平皿，通常需要加入15mL琼脂培养基）。将平皿盖好盖子后放到一个凉的水平平面使琼脂冷却凝固。在培养过程中，培养基会损失水分，当水分损失的量大于培养基总量的15时，就会影响微生物的生长。,凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）放在412冰箱的密封袋中，最多存放一周或按厂商提供的标准执行。在平板底部做好标记，标记的内容包括制备日期和（或）有效期和名称，也可以使用培养基的编码系统进行标记。 将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对琼脂培养基表面进行干燥处理。 对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对

25、琼脂表面进行干燥；干燥时，将平板盖揭开，将平板倒扣于烘箱（培养箱）中（温度设为2050），或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥，商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明操作。,(5)培养 培养时每垛最多堆放6个平板，平板间要留有空隙以进行空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致。对于液体培养基，培养基温度与培养箱达到一致取决于很多因素，如体积、内容物量、容器类型、培养类型等。在使用厌氧罐时，有时堆放的平板数可以超过6个。,(6)培养基的弃置 所有污染的和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，而且要符合国家和地方法规的规定。,2.4成品的质量控制

26、,(1)物理质量的控制 实验室测试至少应包括以下内容：2025时的pH； 观察以下内容： 加入培养基的量和（或）琼脂层的厚度； 色泽； 透明度和（或）是否存在肉眼可见的杂质； 凝胶稳定性（粘稠度）和湿度。,(2)微生物指标控制 A. 污染检测：在每批制备好的培养基选取部分样品进行污染测试。 B. 测试菌株：具有代表性的稳定特征并能有效证明实验室培养基最佳性能的一套菌株。测试菌株主要购于标准菌株保藏中心，也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌株。最好使用从事品种分离的菌株。包括：阳性菌株、阴性菌株等。 C. 即用培养基和试剂：应由商品化即用培养基的生产厂，向使用者提供相应的资质证明。使用者就不

27、必对培养基进行大量的培养基测试工作，但应保证其储存条件。,D. 商品化合成脱水培养基制备的培养基： 对于每批制备好的培养基，除用有效菌株进行测试外，还应用实际样品进行检测，以更好地证明。 不含指示剂的培养基，只需用阳性测试菌株进行检测。 含有指示剂或选择剂的培养基，应使用能证明其指示或选择作用的菌株进行试验。 复合培养基（即需要加入添加成分的培养基）需要用具备有效性能的菌株逐批进行验证，对实验室制备的需加入添加成分的现成培养基同样适用。,1.SN/T 1538.1-2005 培养基制定指南 第一部分：实验室培养基制备质量保证通则。 2.ISO/TS 11133.1-2000 食品和动物饲料的微

28、生物学 培养基制备和生产导则 第1部分 实验室培养基制备的质量保证一般导则 3. SN/T 1538.2-2007 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南。本部分标准规定了培养基的通用质量控制要求并列举了固体和液体培养基的性能测试方法。本部分标准适用于市售和自制培养基的性能测试。, 3.采样和取、制样,样品的采样和取、制样是食品微生物检验的重要组成部分。 要得到准确的检测结果，必需正确掌握采样技术、样品传递、样品保存方法和样品的制备技术，保证样品在从采样到制样整个过程中的一致性。如果样品的采取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不具有代表性，就会使实验室的微生物检验结果毫无意义

29、。 对采样人员和制样人员提出了很高的专业要求，既要保证样品的代表性和一致性，又要保证整个微生物检验过程在无菌操作的条件下完成。,3.1 采 样,采样是指在一定质量或数量的产品中，取一个或多个代表性样品，用于微生物检验的过程。 样品必须对采样的整个产品或批量具有代表性。样品的大小应能满足在需要时进行重复分析的需要。,3.1.1 采样准备工作,1.采样工具 采样工具要达到无菌的要求。对采样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌。 1）开启容器的工具：剪刀、刀子、开罐器、钳子等。双层纸包裹灭菌（121 ，15min），干燥洁净的环境中保存2个月。 2）样品采集工具：灭菌的铲子、勺子、取样器、镊子、锯子、

30、刀子、剪子、压舌板、木（电）钻、打孔器、金属试管和试子等。 3）取样容器：灭菌的广口瓶或细口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金属试管或类似的密封金属容器。最好不使用玻璃容器，运输中易碎。 4）温度计：-20 100 ，温度间隔1 。最好使用金属或电子温度计。使用前在70%75%乙醇溶液或次氯酸钠（浓度不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。,5)消毒剂： 70%75%乙醇溶液、中等浓度（100mg/L）次氯酸钠溶液等。 6）标记工具：标签纸（不干胶标签纸）、油性或不可擦拭记号笔。 7）样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。 8）天平：最大量程为2000g，感量为0.1g。 9）搅拌器和混合器：必要时

31、配备带有灭菌灌的搅拌器或混合器。 10）稀释液：灭菌的磷酸盐缓冲液、0.1%蛋白胨水、生理盐水以及其他稀释液如脑心浸液肉汤、M肉汤、LB肉汤等。 11）防护用品：对样品的防护。即保护生产环境、原料和成品等不会在取样过程中被污染，同样也保护样品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。事先消毒灭菌（或使用一次性无菌物品)。,应根据不同的样品特征和采样环境，对采样物品和试剂进行事先准备和灭菌等工作。 实验室的工作人员进入车间采样时，必须更换工作服，避免将实验室的菌体带入加工环境，造成加工过程的污染。,2.采样方案 微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分

32、析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的采样方案，其次使用正确的采样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。 一般说来，进出口贸易合同对食品采样量有明确规定的，按合同规定采样；进出口贸易合同没有具体采样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定采样方案。 目前的采样方案多为ICMSF推荐的采样方案和随机采样方案。无论采取何种方法采样，每批货物的采样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，采样数量应适当增加，最低不少于8件。,1)采样的术语 批量货物：数量确定的货物，品质必须均匀一

33、致。 抽检货物：从批量货中的一个位置取出的少量货物。 混合货样：条件允许，从某一特定批量采样、混合， 即为混合货样，亦即大样。 样品单位：从监督总体中抽取用于检验的样品中的单 位产品。 样品量：样品中所包含的样品单位数。 合格判定数：在计数采样检查中，对接收批的样品允 许出现的缺陷数或不合格品数的上限 值，合格判定数又称可接受数。 批：一批产品中或特定阶段或时间内代表相同质量样 品的单元数。,随机采样：在一批产品中，每个样品或单元都有同样被选择的机会。这种采样方法被称为随机采样。采样时常需要查阅随机数字表。 代表性样品：广义上讲是指能够代表一个批的样品，而不是仅代表其中的一部分。要获得代表性样

34、品需要以下四个条件：确定整批产品的采样点；建立能够代表整个产品特征的采样方法；选择样品大小；规定采样的频率。,2）采样原则 (1)根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案; (2)应采用随机原则进行采样，确保所采集的样品具有代表性; (3)采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染； (4)样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样品的原有状态。,3）采样方案的类型 依据GB 4789.1-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 (1)类型 采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值，三级采样

35、方案设有n、c、m和M值。,n：同一批次产品应采集的样品件数； c：最大可允许超出m值的样品数； m：微生物指标可接受水平的限量值； M： 微生物指标的最高安全限量值。 注1： 按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。 注2： 按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。,例如：n=5，c=2，m=100 CFU/g，M=1 000 CFU/g。 含义是从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检验结果均小于

36、或等于m值（100 CFU/g），则这种情况是允许的； 若2个样品的结果（X ）位于m值和M值之间（100 CFU/g 1 000 CFU/g），则这种情况也是不允许的。,（2）各类食品的采样方案 按相应产品标准中的规定执行。 （3）食源性疾病及食品安全事件中食品样品的采集 由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集和判定原则按以上的（1）和（2）执行。同时，确保采集现场剩余食品样品。 由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集按GB14938中卫生学检验的要求，以满足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原确证的要求。,4）I

37、CMSF采样方案简介 国际食品微生物标准委员会（ICMSF）所建议的采样计划是目前世界各国在食品微生物工作中常用的采样方案。 ICMSF提出的采样基本原则根据： a)各种微生物本身对人的危害程度各有不 同。 b）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：降低危害度；危害度未变；增加危害度，来设定采样方案并规定其不同采样数。,ICMSF的采样方法,有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。 ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。

38、二级法只设有n、及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。,（1）二级采样方案 自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。 例如生食海产品鱼的副溶血性弧菌标准为n=5，c=0，m=102，n=5即采样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有菌落数超过m值的检样，此批货物为合格品。,（2）三级采样方案 设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条

39、件合格，超过M值者，则为不合格。 例如：冷冻生虾的细菌总数标准n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果允许3个检样的菌落数是在m和M值之间。如果有3个以上检样的菌落数是在m和M值之间或一个检样菌落数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。,（3）ICMSF对食品中微生物的危害度分类与采样方案说明 为了强调采样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的采样方案与食品危害程度相联系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级采样方案，对健康危害低的则建议使用三级采样方案。 ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在

40、一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下面结合表1加以说明。,表1、ICMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类,注：1.表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。 2.“无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。 3.“增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。 4.n：一批产品采样个数。c：该批产品的样品菌落数中，超过限量的 检样数。,根据表1中15种情况的举例，1-3可用三级法，4-5可用二级法来判定是否合格。 考虑到以上15种情况，分别设定不同的取样数及检样污染数，在1-9例中检样需采5个（n

41、=5），而污染检样数设定为c=3，2，1。在10-15例用二级法则不得检出该致病菌c=0。例如冷冻食品，细菌数按例2，大肠菌按例5，金黄色葡萄球菌按例8，沙门氏菌按例11的二级法判定。 对食品处理应酌情考虑，例如生肉火腿中的金黄色葡萄球菌，被腐败菌所抑制，不易发生食物中毒，适用例7和例8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌没有抵抗力，则易发生食物中毒，适用例9。加热盐腌的火腿，水分活性为0.86以下，金黄色葡萄球菌有增殖的可能性，因此适用例9。沙门氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，适用例11，如上所述，应根据各种食品的危害度进行设定。,ICMSF方法是以二级法、三级法和抽样的概念为基础，再将微生物的知

42、识加进来，则可以提出各种食品的微生物标准。如表2。 为了安全，冷冻生虾加热吃，减少危害度适用例1、4、10。冷冻加工虾，为了不加热就食，在解冻中有增强危害度的可能性，适用例3、6、9、12，对象微生物特别指定金黄色葡萄球菌肠毒素，两者虽菌数限量是相同的，但情况有所不同，分别适用c=3，c=1，因此不依靠菌数限量，而用合格率来控制。,表2、ICMSF虾的微生物标准,注：n：一批产品采样个数。 c：该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。 m：合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。 M：附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数

43、之间的界限。,5）随机采样方案 在现场采样时，可利用随机采样表进行随机采样。随机采样表（SN 0330-1994出口食品中微生物检验通则系用计算机随机编制而成，包括一万个数字。其使用方法如下： a.先将一批产品的各单位产品（如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批600包的产品编为1、2600。 b.随意在表上点出一个数。查看该数字所在的行和列。如点在第48行、第10列的数字上。 c.根据单位产品编号的最大位数（如A1，最大为三位数），查出所在行的连续列数字（如A2所点数为第48行、第10、11和12列，其数字为245），则编号与该数相同的那一份单位产品，即为一件应抽取的样品。 d.继续查下一行的

44、相同连续列数字（如按A3、即第49行的第10、11和12列的数字，为608）。该数字所代表的单位产品为另一件应抽取的样品。 e.依次按A4所述方法查下去。当遇到所查数超过最大编号数量（如第50行的第10、11和12列的数字为931、大于600）则舍去此数，继续查下一行相同列数，直到完成应抽样品件数为止。,3.1.2采样方法 确定了采样方案以后，采样方法对采样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。 采样必须遵循无菌操作程序，采样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。 采样全过程中，应采取必要的措施

45、防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。 确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。,各类食品的采样方法 采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌、干燥、防漏，形状及大小适宜。 1即食类预包装食品： 取相同批次的最小零售原包装，检验前要保持包装的完整，避免污染。 2非即食类预包装食品 ： 原包装小于500 g的固态食品或小于500 mL的液态食品，取相同批次的最小零售原包装；大于500 mL 的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后分别从相同批次的n个容器中采集5倍或以上检验单位的样品；大于500g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分

46、别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。,3散装食品或现场制作食品： 根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。 4食源性疾病及食品安全事件的食品样品 采样量应满足食源性疾病诊断和食品安全事件病因判定的检验要求。,3.2样品的标记和运输 应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。 3.2.1样品的标记 （1）所有盛样容器必须有和样品一致的标记

47、。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。 （2）当样品需要托运或由非专职采样人员运送时，必须封识样品容器。,3.2.2样品的保存和运送 （1）采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。例如冷冻样品应存放在-15以下冰箱或冷藏库内；冷却和易腐食品存放在0-4冰箱或冷却库内；其他食品可放在常温冷暗处。 （2）运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。必要时可于途中补加冷却剂或冷冻剂。 （3）如不能由专

48、人携带送样时，也可托运。托运前必须将样品包装好，应能防破损，防冻结或防易腐和冷冻样品升温或融化。在包装上应注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字样。 （4）作好样品运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字。 3.2.3.2保存方法 联合国粮农组织 (FAO)推荐的样品保存方式可作参考。,3 样品的制备 3.3.1 样品检验 实验室样品的制备是微生物检验的重要环节，是获得较高准确性和良好检验结果的基础。 3.3.1.1样品处理 1）实验室接到送检样品后，应认真核对登记，确保样品的相关信息完整并符合检验要求。 2）实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验，应采取必要的

49、措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。 3）冷冻食品应在45以下不超过15min，或25不超过18h解冻后进行检验。,3.3.1.2检验方法的选择 GB 4789.1-2010要求: 1）应选择现行有效的国家标准方法。 2）食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定性检验方法时， 应以常规培养方法为基准方法。 3）食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时， 应以平板计数法为基准方法。,GB/T 4789.1725-2003中分别规定了肉与肉制品、乳与乳制品、蛋与蛋制品、水产食品、清凉饮料、调味品、冷食菜和豆制品、糖果和

50、糕点及果脯、酒类的样品的制备方法。 以上标准规定使用的稀释剂均为无菌蒸馏水或生理盐水，大多数产品标准也主要使用这两种稀释剂，而且对待检样品的制备方式相当单一。反映出我国相关标准比较滞后，缺乏先进性，微生物样品制备的方法在实际应用中针对性差，操作性不强。,由于食品种类繁多，在实际微生物检验中尽可能采用统一的样品制备方法。对于许多特殊产品，由于产品本身的物理状态（如干品、粘稠度高的产品等）、样品中抑制剂存在（如大蒜制品、洋葱制品、咸鱼等）或酸性等原因，需要采用特殊的样品制备方法。包括： 1）调整食品稀释液的pH至中性； 2）对于含高抑制物质（成分）的产品（如大蒜制品、洋葱制品等）或所含微生物受损的

51、产品（如酸性食品、盐渍食品、干制食品等），使用缓冲蛋白胨水或其他稀释剂（如D/E中和肉汤、脑心浸液肉汤等）； 3）对于低水分活度的食物，需要采取特殊复水程序；,4）调整适当温度和静置时间，以利于可可粉、明胶、奶粉等样品的悬浮； 5）对于来自食物加工或贮存过程中的受损微生物，需要采取特殊复苏程序； 6）某些产品（如谷物）和（或）目标菌（如酵母菌和霉菌）的特殊均质程序及均质时间； 7）对于高脂肪食品，使用表面活性剂（如1g/L到10g/L聚山梨醇酯80），促进悬浮过程中的乳化作用。,3.3.2 稀释液的选择 3.3.2.1常用和特殊稀释液 常用稀释液包括：0.85%生理盐水、缓冲蛋白胨水（BPW）

52、、0.1%蛋白胨水、磷酸盐缓冲溶液、无菌蒸馏水等。 特殊稀释液包括：D/E中和肉汤、LB肉汤、M肉汤等。 最合适的稀释液应该通过一系列的试验得到，所选择的稀释液应该具有最高的复苏率。,3.3.2.2 厌氧微生物的稀释液 应使用具有抗氧化作用的培养基作为稀释液。制备样品悬液时应尽量避免氧气进入，使用袋式拍击式均质器。 配备一些特殊的样品防护措施，如厌氧工作站等。 3.3.2.3 嗜渗菌和嗜盐菌的稀释液 20%的无菌蔗糖溶液适用于嗜渗菌计数；研究嗜盐菌时，可使用15%无菌的氯化钠溶液作为稀释液。,3.3.3 不同类型样品的取、制样 常用取样工具包括：均质器及均质杯、拍击器及拍击袋、试管、刻度吸管、

53、微量移液器、玻璃珠、检测天平、水浴锅、玻璃棒、酒精灯、镊子、刀子、电锯、托盘等。 3.3.3.1 液体样品 制备液体样品稀释液时。用无菌移液管取10mL完全混匀的样品到带盖的无菌玻璃瓶中。加稀释液至100mL配成体积比为1：10的稀释液。也可选择质量体积比，取10g完全混匀的样品加入玻璃瓶，用无菌稀释液配制成100mL，制成质量体积比为1：10的稀释液。实际操作中，等效于1：10的质量比。按常规方法做进一步的稀释，整个样品稀释过程在30min内完成。,3.3.3.2 小颗粒固体样品 面粉和奶粉等小颗粒固体样品的初识稀释液较容易配制。无菌称取10g样品加入到容积为100mL的无菌带盖玻璃瓶中，加

54、入无菌稀释液至100mL刻度，配成质量体积比为1：10的稀释液。以30cm的幅度摇动25次。必要时按常规方法进一步稀释。对高溶解度样品计数时必须小心，计数结果取决于样品在稀释液中的均匀性，而均匀性又与样品的初识状态有关（常表述为个/g）。要得到准确的检测结果，第一个稀释液的体积是否准确达到100mL非常重要。除体积因素外，pH和水活度的变化也必须加以考虑。另外，稀释液中样品的转接应在30min内完成。,3.3.3.3 粉末状样品 检测表层下面样品中的细菌时，应至少取10g样品加入适量的无菌稀释液，并在适当的设备中均质。常用的均质方法是使用拍击式均质器。 将样品和稀释液一起放入无菌、耐用、薄而软

55、的聚乙烯袋中，不接触均质器。均质时不会引起样品温度升高，较好地保护了待测样品。即使是冷冻样品，均质效果也很好。这种方法可用于制备浓度很低的稀释液。,3.3.3.4 表面样品 表面样品取样后，先放到一定体积（如10mL）的稀释液中，妥善保存，使样品保持原始状态。检测时，用适当的稀释剂进行定量稀释（根据预测的污染程度稀释到所需稀释度）。检测后根据稀释的倍数进行换算。,4接种、分离纯化,4.1接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。,4.1.1接种工具,1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,图4-1接种和分离工具

56、,4.1.2无菌操作,培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。,接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。 接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，

57、通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。,4.2接种法与纯培养的分离技术,含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。 如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。 在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。,4.2.1平板划线分离培养法,平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根

58、据菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。 分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图4-2）,图4-2平板划线分离法,1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,1.曲线划线分离法,1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许; 2) 左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和食指将平板盖打开； 3)右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈45角，在酒精灯上方56cm处划线接种。先在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作连续划线接种，线与线

59、间留有适当距离，将整个平板表面划满曲线； 4)注明标识后，置35培养箱中培养，一般在1824小时后观察结果。,2.斜线(分区)划线分离法,1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3区依次划线。 2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。 3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线12次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。 4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。,3.方格划线法,将培养物涂布于平板上1/5处，接种环经火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线56条，将接种环灭菌后，划垂直线56条，使呈正方形格。其他操作同前。,细菌在固体培养基表面只能在固定的地方生长繁殖，经过一定的培养时间