《突变位点的检测》PPT课件.ppt

1、2 主要核酸操作技术,核酸凝胶电泳技术 核酸分离技术 PCR技术 mRNA的纯化和文库的构建 基因克隆技术 DNA序列分析技术 突变位点的检测,主要内容,遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术,遗传标记,遗传标记：形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记 分子标记（Molecular Markers） 广义：可遗传并可检测的特异DNA序列、RNA或蛋白质。 狭义：指DNA或RNA标记。 DNA遗传标记：指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。 DNA遗传标记的种类（P436）： 限制性片段长度多态性RFLP、简单重复序列（S

2、SR）、SNP。,主要内容,遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术,DNA遗传标记(P437),第一代标记： 限制性片段长度多态性（RFLP） 定义：用限制性内切酶特异性切割DNA链，由于DNA的一个“点”上的变异所造成的能切与不能切两种状况，可产生不同长度的片段，可用凝胶电泳显示多态性。 优点：广泛用于检测已知DNA点突变，可以检测大到几千个碱基对DNA片段；对SNP位点检测和基因分型均能较准确的判断。 缺点：限制性酶切过程中不可避免的遭遇到酶切不完全或DNA降解的现象，且只能检测已知多态位点，不能罕见的或未知的突变位点；每次酶切2-3个片段，信息量有限；限制性内切酶价格

3、较昂贵。,DNA遗传标记,第二代标记：简单重复序列（SSR） 定义：真核生物基因组中散布有由大量由简单重复序列所组成的微卫星和由串联重复短序列组成的小卫星。在小卫星或微卫星的两端往往是相对保守的限制性内切酶位点。通过特异性引物进行PCR扩增、凝胶电泳和放射自显影（或银染），可以检测到在简单重复序列中由于重复单位数不同而造成的DNA区域的多态性。 优点：与RFLP标记相比SSR检测的多态性频率高得多。 应用：基因定位、DNA指纹分析、遗传分析和疾病诊断等。 缺点：要克隆足够数量的SSR并进行测序，需要投入足够的资金、人力和时间。,DNA遗传标记,第三代标记：SNP 定义：基因组DNA序列中单个核

4、苷酸的突变引起的多态性。 SNP是基因组中最简单、最常见的多态形式，具有很高的遗传稳定性。 已经在人类基因组中发现了超过1000万个SNP位点，平均约每300bp就有一个SNP。 绝大多数SNP位于非编码区。 优点：可用于检测未知突变；可以与DNA芯片技术相结合实现自动化检测。 缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受检测条件影响。,DNA遗传标记,依据DNA遗传标记进行基因分型。 P473基因型（genotype）： 人：除性染色体外，人类细胞内的染色体都有两份，一个人所拥有的一对等位位点的类型被称为-。 泛指：同一基因座位上多个等位位点的类型。 基因分型（genotyping）：确定某个个体基

5、因型的实验。 等位位点（P66）：指染色体DNA同一位置上的每个碱基类型。,主要内容,遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术,基因突变,定义：由于体内外各种因素使基因特定的DNA序列的碱基组成或排列顺序发生改变，导致DNA一级结构改变。 根据分子机制不同分为：插入突变、缺失突变、点突变 。 插入/缺失突变：DNA序列插入/缺失一个或多个核苷酸的突变。 eg. 转座子（复制型转座子、非复制型转座子）。,基因突变,点突变：指一种碱基通过化学修饰、遗传变异、复制错误等引起的单一碱基的改变。 分为转换（transition）和颠换（transversion）。 转换最常见，约占SN

6、P的2/3。,主要内容,遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术,SNP (P66),SNP广泛存在于人类基因组中。 单倍/体型（haplotype）：位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称为-。 相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代（图2-42）。 34个相邻的SNP标记构成的单体型就可有816种。,SNP,SNP分类： 根据SNP在基因组中的分布位置，可分为： cSNP（1/5）、pSNP、rSNP。 从对生物遗传性状的影响上看，cSNP又可分为： 同义cSNP、非同义cSNP 。 SNP的应用（P69）： 人类基因单体型图的绘制 SNP与疾病易

7、感基因的相关性分析 指导用药与药物设计 动物、植物、微生物的遗产改造/育种,主要内容,遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术,SNP检测技术（课下拓展，各技术有何优缺点）,限制性酶切片段长度多态性分析-RFLP 单链构象多态性分析-SSCP 毛细管电泳 变性高效液相色谱-DHPLC 异源双链分析-HA 变性梯度凝胶电泳分析-DGGE DNA芯片技术-DNA chip 实时荧光PCR分析 直接序列测定， ,PCR,SNP检测技术, PCR-RFLP： 原理：先用PCR技术扩增目的基因片段，由于DNA个别碱基的突变，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割目的片

8、段，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。 P427：,突变位点的检测技术,单链构象多态性（SSCP）： 是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象，在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位。 优点：简单快速，价廉，特别适合大样本的筛选；用SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，检出率可达70-95。 缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受凝胶交联度、电泳温度、片断长度等条件影响，当片段大于400bp时

9、，检出率仅为50左右；同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。,突变位点的检测技术,异源双链分析法（HA） 原理： 由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA不同的迁率。 优点：HA是SSCP法鲜为人知的姊妹篇，操作也比较简便。 HA和SSCP两种方法突变检测模式不同，两种方法可以同时在同一张凝胶上进行，二者可以相互掩盖对方的缺点与不足，使突变检出率提高到近100。 缺点： 只能分离双链DNA；也只适合于小片段的分析。,SNP检测技术,实时荧光PCR分析 原理：使用针对核酸中不同多态性序列的荧光探针，

10、只有与靶序列完全匹配的探针才能被相应的切割，它们在PCR扩增中被水解切割释放出荧光信号，不同探针标记不同的荧光报道信号。 优点：操作方便简单，实验时间是现有方法中最短的，重复性强，适合于大量样本的检测；同时整个实验是在闭管的状态下完成，可以非常有效避免污染；结果判断借助仪器软件自动判读，客观性强。缺点：只能对已知的多态性位点进行分析；需要专门的仪器、试剂。,SNP检测技术,基因芯片法 (DNA chip) ： 原理：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的已知序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，

11、确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。 优点：快速简单、自动化程度高，使SNPs的分析更加便捷，具有很大的发展潜力；还可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。 缺点：需要专门的仪器、试剂，费用较高。,直接测序测定： 是诊断未知突变基因最直接的方法，其方法是将PCR产物在自动测序仪上直接测序。 优点：操作简便，测序时间短。 缺点：费用昂贵，仅适合于小样本量分析。,SNP检测技术,思考,简述DNA遗传标记的种类？,突变位点的检测技术,变性梯度凝胶电泳法（DGGE） 原理：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝 胶位置时，DNA发生部分解

12、链，电泳迁移率下降；当解链的DNA链中有一 个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度不 同而被分离。 优点：检测片段可达1kb，最适范围为100bp-500bp，如果突变发在 最先解链的DNA区域，检出率可达100；检测结果无假阳性重复性好， 准确率高，可判断基因型；该法一经建立，操作也较便，适合于大样本的 检测筛选。 缺点：由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专的 电泳装置，合成的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夹，以 利于检测发生于高熔点区的突变。,突变位点的检测技术,变性高效液相色谱检测（DHPLC） 原理：含有突变位点的PCR 扩

13、增产物经变性、退火，将形成同源和异 源双链两种DNA 分子。在部分变性条件下，发生错配的异源双链DNA 更 易于解链为单链DNA，与DNASep 柱结合力降低，比同源双链DNA 分 子更易于被乙腈洗脱下来，从而与同源双链DNA 分离。 优点：分离DNA分子快速，操作自动化、简便，经济； PCR产物无须 进行纯化处理即可用于突变检测；能准确测定DNA片段大小，基因突变检 出率高（达95-100%） 。 缺点： DHPLC 检测的灵敏性、特异性受PCR引物、PCR 体系及反 应条件、检测温度、DNASep柱质量以及流动相梯度等多重影响。,突变位点的检测技术,蛋白截断技术（PTT） 由于基因的非缺失型突变多可能造成翻译过程的提前终止(突出表现 为点突变形成终止密码子)，其蛋白质产物为截短肽链；在SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳，这种突变杂合子电泳