PCR试剂盒的选用和质检.ppt

1、临床PCR试剂盒的选择和质量检验，卫生部临床检验中心李，PCR或RT-PCR试剂盒的组成，核酸提取试剂，核酸扩增试剂或反转录-核酸扩增试剂，产品检测试剂(有些PCR方法使用自动分析仪，因为其核酸扩增和检测是同时完成的，所以没有专门的产品检测试剂)，影响PCR试剂盒质量的因素，内在因素：原料， 核酸提取方法、方法设计、影响聚合酶链反应试剂盒质量的因素：扩增所需的原料、寡核苷酸引物和探针缓冲液、脱氧核糖核酸聚合酶、逆转录酶等。聚合酶链反应混合物、Mg2、Mn2、DCTP、DGTP、Dutp、DATP、Taq DNA聚合酶、RTth DNA聚合酶、AmpErase、生物物质标记的引物和/或寡核苷酸引

2、物和探针，其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯度可以根据吸光度比率260/280来判断。如果是2.0，则需要再次纯化。另一种方法是在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。如果出现多个条带或迁移位置错误，则需要再次纯化。是否有污染。结合特异性(浓度)、dNTP和缓冲液、dNTP的浓度缓冲液(包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP):在储存和扩增循环中稳定的镁(或锰)的浓度和酸碱度、逆转录酶、脱氧核糖核酸聚合酶、酶浓度和酶活性、核酸扩增方法、聚合酶链反应-逆转录聚合酶链反应转录依赖性扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)等。影响聚合酶链反应试剂盒质量的因素有核酸提取、核酸提取的

3、有效性、核酸提取的简便性、产物检测、杂交固相特异性探针及其标记、影响聚合酶链反应试剂盒质量的因素、内在因素：原料、核酸提取方法、方法设计外部因素：试剂盒的运输和储存外部因素：试剂盒的运输和储存、试剂盒的运输和储存，聚合酶链反应试剂盒的有效期一般为6个月，这意味着在适当的储存温度下。核酸扩增试剂一般储存在-20。一些用于产品检测的试剂储存在28。从制造商到用户，试剂盒在运输过程中必须经过运输和储存，任何不适当的环节都会影响试剂盒的临床使用质量。聚合酶链反应试剂盒的分类、定性测定：聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应-膜杂交(杂交梳)、荧光聚合酶链反应(分子信标和塔克曼等)。)定量测定：聚

4、合酶链反应-酶联免疫吸附试验、Taq Man和扩增子传感器荧光定量、扩增子聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验定量等。聚合酶链反应试剂盒的选择原则，参照试剂生产厂家的信息广告，参照同行对相关试剂盒的使用效果，参照相关机构根据使用目的、实验室的技术特点、患者在医院的承受能力、聚合酶链反应试剂盒的质量检验以及外包装：生产厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等进行的综合评价。内包装：试剂瓶是否泄漏，真空包装是否损坏，试剂是否齐全，是否有说明书等。聚合酶链反应试剂盒的质量检验(定性测定)和性能的质量检验采用血清(样品)板：聚合酶链反应试剂的血清(样品)板由一定数量的原血清阴性和阳性样品、23个纯化核酸

5、(脱氧核糖核酸或核糖核酸或核糖核酸)样品和35个系列稀释阳性样品组成。样本总数可以设置为大约20个。利用原始血清样本判断试剂盒对特定病原体核酸检测的特异性、敏感性和符合率；纯化的核酸样品用于判断DNA扩增或反转录和DNA扩增的有效性；系列稀释阳性样品用于判断试剂测定的下限。试剂特异性、灵敏度和符合率公式，灵敏度()(a/a c)100%特异性()(d/b d) 100%符合率()(a/d a b c d)100%，质量检验(定量测定)的PCR试剂盒，样品：质量检验内容：测定的重复性、抗干扰能力、技术验收，依据：扩增检验临床实验室管理暂行办法(卫200210)、临床基因扩增实验室工作规范(卫20

6、02第8号)、技术验收内容、实验室设置和设备管理及环境人员检测方法、设备管理、检测方法、标本管理记录、报告、质量控制投诉等。实验室分区：标准化分区，清晰的识别标志，防止污染：气流方向，中央空调，每个区域的密封。各区域设备和物品配备：充足、科学、专用(标识)、“生物安全柜”、“移动式紫外线灯”、“进样器”、设施和环境。本章包括五篇文章；实验室设施、工作区域、能源、照明等。环境和实验条件控制设施：温湿度计、不间断或稳定电源等。实验室出入的限制和控制：“内务管理”制度(如人员流动和清洁等)。)以及相应的人员进入控制标志和生物感染风险标志设施；废血清处理和生物保护等措施，相应设施、设施和环境中需要注意

7、的问题，清洁程序或系统，清洁工具的特殊使用，清洁工作的单一流向，清洁方法的特异性，废血清处理的生物保护，工人和环境的保护，尖锐器具的使用规则，生物感染性危险废物离开实验室前的预处理，人员，本章包括三条。人员数量充足；带培训证书的培训计划：定期室内培训(记录)人员技术(资格、培训、技能)档案。设备管理(1)，本章包括三个部分。应妥善维护主要仪器设备，并提供设备维护程序文件。除了维护记录外，进样器、温度计、放大器和酶标仪等设备应有校准程序文件和表明其校准状态(本次校准时间和下次校准时间)的明显标记。实验室应保存每台仪器设备的档案，并明确档案的具体内容。(2)、设备和质量控制材料，每个设备的文件内容

8、包括：(a)设备名称；制造商的名称、型号和序列号；收货日期和开业日期；当前位置；(e)收到时的状态；有一份仪器说明书；(g)校准和/或验证的日期和结果以及下一次校准和/或验证的日期；迄今进行的维护的细节和未来的维护计划；损坏、故障、修改或修理的历史。测试方法，本章包括三个。标准操作程序：仪器和设备的操作和校准程序；样本收集和处理程序；扩增检测工序；仪器和试剂的采购和质量检验程序；消耗性材料的采购、验收、质量检验和储存程序。标准操作程序应该有效且易于使用。规范化管理，本章包括五个部分。建立独特的号码识别系统，避免标本混淆；标本采集、运输和保存程序；样品接收的状态记录；样本的适用性和充分性；标本储

9、存和储存温度控制措施的标准操作程序；样本接收和安全处置程序；保持实验室诚信的必要措施。记录，这一章包括三个。记录管理制度：适合自身实际情况，符合现行规章制度；原始记录、计算和导出数据应存档和保存(谁、在哪里和保存多长时间);记录应由相关人员签字；所有记录和报告应妥善保存并保密。、报告、检测结果报告应准确、清晰、客观；定性测量报告“阴性”或“阳性”；定量测定报告为拷贝数/毫升或国际单位/毫升。避免两者之间的混淆；每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、试样描述、试样特征和状态、试样接收日期和试验日期、试验方法、试验和检验人员的签名和签发日期、参考结果或范围；如对报告的有效性有任何疑问，实验室应立即通知相关临床部门纠正程序；报告分发程序：通过电话、传真和电子邮件报告结果时的保密原则。质量控制体系，实验室应有一个室内质量控制标准操作程序，对质控的来源、浓度和阴性批号选择统计质量控制方法(如何得到平均值和标准差)。标准失控后该怎么办？实验室应参与室内质量评估。如有投诉，实验室应制定标准操作程序；投诉及其处理；不同投诉的可操作性和处理。如果