3-基因工程原理ds-测序技术

基因工程原理何光源2021-3-102024/5/2造福人类的HGP2024/5/2第一节DNA测序策略DNA的测序策略因待测DNA分子性质、测序方法和测序目的不同而有所不同。在测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以及现有设施来制定测序总策略。一、序列确实证性测序策略二、未知序列的从头测序策略2024/5/2一、序列确实证性测序策略确证性测序〔confirmatorysequencing〕：对的核酸序列进行鉴定和证实；例如：临床分子诊断中，对有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变；不仅有助于临床诊断，还有助于探索有关疾病的发病机理及基因突变引起的表型变化。2024/5/2一、序列确实证性测序策略多数情况下，确证性测序的DNA片段较小，一套反响即可获得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只需对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段适宜的限制酶切片段进行测序；待测DNA片段位于通用引物的测序范围之内时，可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷酸片段作为“通用引物〞；否那么，最好的方法是合成一段长度为18-20核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约50-100核苷酸的序列互补。2024/5/2〔一〕随机测序法鸟枪法shotgunstrategy利用超声处理、核酸酶Ⅰ〔DNaseⅠ〕切割或限制性酶切割，将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，含有子片段的亚克隆扩增后分别进行DNA序列测定，然后将序列重叠排列，确定待测DNA的完整序列；该法所获得的序列由许多序列累积产生，结果准确；但由于测序的亚克隆是随机挑选出来，某些序列可能屡次重复测定，而一些序列一直不出现，通常要测定比实际靶DNA所含核苷酸多4～7倍的序列；如果靶DNA含较多的重复序列，计算机将难以进行分析。2024/5/2〔二〕定向测序法定向测序法〔directedsequencing〕：指从待测DNA片段的某一端开始按顺序进行测序，直至将待测DNA的序列全部测完；该类方法具有方向性，不会出现大量重复测定的现象；主要包括：嵌套缺失法和引物步入法。2024/5/2〔二〕定向测序法1．嵌套缺失法嵌套缺失法〔nesteddeletion〕：利用工具酶酶解待测DNA，只要控制消化时间，即可产生一组从同一端缺失的长度不一的互套缺失突变体，测定其序列，通过相互重叠局部将相邻片段的序列彼此拼接，如此重叠互套，获得待测DNA的全序列；产生互套缺失突变体的主要工具酶：核酸外切酶III、核酸酶Bal31、DNA酶I和T4DNA聚合酶。2024/5/2〔二〕定向测序法用外切酶Ⅲ构建互套缺失突变体测序方法示意图2024/5/2〔二〕定向测序法2．引物步入法引物步入法〔primerwalking〕：从待测DNA片段的3’端开始，利用载体上的序列设计第一次反响的引物，测定一段DNA序列，然后依次根据前一次测序结果，设计下一次反响引物，循序渐进测序，直至完成，得到靶DNA的全部序列。2024/5/2〔二〕定向测序法引物步入法测序原理示意图2024/5/2KeyGenomicsTechnologies1975-SouthernDNAhybridizationtechnique1977-Sanger’schain-terminationandMaxam、Gilbert’schemicalDNAsequencingmethods1980-Automatedinsituoligonucleotidesynthesisinstrument1985-Mullis’sdiscoveryofPCRatCetus1992-Affymetrix(Fodor’sgroup)firstgene-chip1995-ABI’sfirstautomatedDNAsequencer2006-2ndgenerationDNAsequenceronmarket2007andbeyond–Singlemoleculesequencingtechniques2024/5/22024/5/2第二节传统的DNA序列分析法Sanger双脱氧链终止法Maxam-GilbertDNA化学修饰法DNA杂交测序毛细管电泳DNA序列分析的自动化2024/5/21970年创造了第一种DNA测序方法2024/5/2Sanger双脱氧链终止法Sanger于1977年在加减法测序的根底上创立了双脱氧链末端合成终止法〔chainterminationmethod〕，简称Sanger法、双脱氧法或酶法。2024/5/2一、根本原理单链DNA模板、DNA合成引物、DNA聚合酶以单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的延长2024/5/2双脱氧链终止法的测序根底是以双脱氧核苷三磷酸为测序反响的链终止剂。2024/5/22024/5/2

POHdNTPddNTP

POHOH

P

P

P

POH2024/5/22024/5/22024/5/2双脱氧链末端终止法测序原理示意图2024/5/2二、测序反响体系的组成2024/5/2Sanger双脱氧-M13体系M13--噬菌体载体，可得到单链DNA序列Sanger双脱氧-pUC体系

pUC-质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法2024/5/22024/5/22024/5/22024/5/22024/5/2二、测序反响体系的组成〔二〕引物“通用〞引物：在DNA聚合酶催化的测序反响中需要测序引物。不管是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用〞引物；通用引物长度：一般为15～30个核苷酸。2024/5/2二、测序反响体系的组成〔三〕DNA聚合酶1．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow片段〕：Sanger法最早使用的酶，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，催化链延伸反响的能力较差，用它进行测序常产生较高的本底和假带；2．测序酶〔sequenase〕：经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性。酶活非常稳定，很高的链延伸能力和极快的聚合反响速度，测定较长DNA的首选酶；3．TaqDNA聚合酶：PCR反响关键酶，在95℃的高温下保持稳定，可在高温下进行反响，该酶用于测序具有很好的链延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。2024/5/2二、测序反响体系的组成〔四〕放射性核素标记的dNTPα-32P-dNTP或α-35S-dNTP。目前通常采用α-35S-dNTP。2024/5/2二、测序反响体系的组成〔五〕测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反响中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效别离是序列分析成败的关键。2024/5/2三、Sanger双脱氧链终止法的特点1.快速简便，一次反响可测500个以上的碱基序列；2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要。2024/5/2Maxam-GilbertDNA化学修饰法1977年哈佛大学A.M.Maxam和W.Gilbertf创造原理：化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割产生一组具有不同长度的DNA链混合物经凝胶电泳别离和放射自显影，读出待测DNA片段的核苷酸序列2024/5/2由于这种化学切割反响的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反响必定是定量的化学切割反响的试剂：肼hydrazine联氨NH2-NH2硫酸二甲酯dimethylsulphate六氢吡啶2024/5/2碱性条件下，肼与胸腺嘧啶〔T〕和胞嘧啶〔C〕作用通过六氢吡啶作用，使两个磷酸分子从糖片段上释放出来，导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂盐存在的条件下，肼同T的反响被抑制，只发生胞嘧啶碱基特异的切割反响由此区别C和C+T两种反响2024/5/2硫酸二甲酯〔(CH3O)2SO4〕一种碱性的化学试剂作用于DNA碱基环中的氮原子，使之甲基化在中性的pH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱碱性条件下磷酸分子从DNA链上脱落，造成链的断裂鸟嘌呤〔G〕的N7>腺嘌呤(A)的N3六氢吡啶作用，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂2024/5/22024/5/2CS载体系统：末端标记载体核酸内切酶Th111Ⅰ特点：产生5’单碱基的突出末端，便于标记；Th111Ⅰ位点十分稀少；5’突出末端可以是G或A，也可以是T或C，选择性强；在载体中具有两个Th111Ⅰ位点，可对克隆在载体上的片段任何一段作选择性标记2024/5/2化学修饰法的优点：不需要体外酶切；只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。限制因素：测序胶的分辨率2024/5/2DNA杂交测序原理：如果一段短的DNA探针能够与较长的靶DNA片段杂交，并形成完全的双链分子，可据此推断靶DNA序列相对应的互补序列步骤：将待测的靶DNA分子与一组核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交比较分析与待测DNA杂交的探针之间的碱基重叠关系，据此推算靶DNA的核苷酸序列2024/5/22024/5/2两种操作方式：1.将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交2.应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法2024/5/2杂交测序的应用2024/5/2毛细管电泳2024/5/22024/5/22024/5/2〔三〕阵列毛细管电泳CAE，Capillaryarrayelectrophoresis将毛细管电泳与板凝胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装置，将多支毛细管并列进行别离与检测，以板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的缺乏，可一次检测多个样品；阵列毛细管电泳散热效率高，适于高电场强度电泳，是一种高速、高通量的测序法；使用非凝胶基质，毛细管壁可以抑制横向扩散，具有易于实现自动化的优点。2024/5/2DNA序列分析的自动化激光测序法终止标记系统用4种不同的荧光染料标记不同的ddNTP；测序反响在同一反响管内进行，不必分成4管；反响产物按终止位置的碱基不同其3’末端带有不同的荧光基团，被激发后产生不同的荧光；将反响产物加样于凝胶的同一加样孔，电泳别离后，经过DNA测序仪分析系统识别，将检测将信号不断传送到计算机，通过软件分析，自动读出待测DNA的全部核苷酸序列。2024/5/2激光测序法终止标记系统测序原理示意图2024/5/2测序仪原理1.荧光标记BigDyeTerminators--美国应用生物系统公司专利，四色荧光分别标记的起链终止剂作用的四种ddNTPs；一个反响管中完成循环测序反响，通过一个电泳道电泳即可完成测序任务；传统双脱氧链终止法：四个反响管循环测序反响，四个泳道电泳检测2024/5/22.循环测序2024/5/2377型遗传分析仪310型遗传分析仪3100遗传分析仪

3730遗传分析仪

2024/5/22024/5/2NextGenerationSequencingSamplefragmentationLibrarypreparationSequencingreactionDataanalysisRoche454焦磷酸测序PyrophosphateSequencingIlluminaSolexa合成测序SequencebySynthesizeABISOLiD连接法测序SequencebyLigation2024/5/2表目前使用最广泛的三大第二代测序平台测序能力统计信息〔2021年年初数据〕厂商RocheIlluminaABI技术454SolexaGASOLiD测序仪GS20FLXTiIIIIIx123序列数目（百万）0.50.51.252810025040115320单末端测序（Single-end）读长（bp）1002004003550100253550运行时间（天）0.250.30.4335658通量（Gb）0.050.10.515251416配对末端测序（Paired-end）3个水稻基因组/天12个水稻基因组/天10个水稻基因组/天读长（bp）

2004002×352×502×1002×252×352×50库序列长度（kb）

3.53.50.20.20.2332运行时间（天）

0.30.461010121016通量（Gb）

0.10.529502832Solexa和SOLiD配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍，454的配对末端和单末端差异在于建库方法，所需时间和测序量不变。ABISOLiD包含两张芯片，这里的数据是一张芯片的量。2024/5/2Roche454焦磷酸测序2024/5/2原理荧光素酶硫酸化酶焦磷酸荧光素氧化荧光素可见光2024/5/22024/5/2测序原理体外构建好的两端带接头的单链DNA文库；单链DNA文库在一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增由于起始阶段模板浓度非常低，因此大局部包含磁珠的乳液滴都只含有一种模板；经PCR扩增，每个磁珠只连有一种模板的扩增产物打破为乳液滴，收集磁珠，参加芯片中；2024/5/2测序原理经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被置于芯片上的微孔中；焦磷酸法测序每一轮反响都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦磷酸；焦磷酸和腺苷酰硫酸在硫酸化酶的催化下生成ATP；荧光素酶在ATP参与下将荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器检测到。2024/5/2工作流程文库制备乳液PCR焦磷酸测序参加含酶小微珠芯片制备2024/5/2工作流程一、样品输入并片段化基因组DNA、BAC等被打断成300－800bp的片段；对于小分子非编码RNA或者PCR扩增产物，直接使用二、文库制备将A和B接头〔3’和5’端具有特异性〕连接到DNA片段上；接头将用于后续的纯化、扩增和测序步骤；具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。2024/5/2工作流程三、一个DNA片段连接一个磁珠单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段；磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，成为只包含一个磁珠和一个独特片段的微反响器。四、乳液PCR扩增每个独特的片段在自己的微反响器里进行独立的扩增，没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个片段文库的扩增平行进行；每一个片段扩增后产生几百万个相同的拷贝；乳液混合物被打破，扩增的片段结合在磁珠上。2024/5/2工作流程五、测序携带DNA的捕获磁珠〔20m〕随后放入PTP板〔Pico

TiterPlate〕的微孔〔29m〕中进行后继的测序反响；反响释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到，有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，可以准确快速地确定待测模板的碱基序列六、数据分析454测序系统可以在10小时的运行当中获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息；提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。2024/5/2454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)GenerationofmillionsofclonallyamplifiedtemplatesoneachbeadNocloningandcolonypickingMixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)“Breakmicro-reactors”IsolateDNAcontainingbeadsCreate“Water-in-oil”emulsion+PCRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementEnrichAnnealSeqprimer2024/5/2454sequencing：DepositionofDNAbeadsinto thePicoTiter™PlateCentrifugeStepLoadEnzymeBeadsLoadbeadsintoPicoTiter™Plate2024/5/2454测序系统图示A为液体试剂供给装置B为反响池C为光线检测成像系统和计算机控制系统2024/5/2测序质量2024/5/2图a为高通量鸟枪Sanger测序法策略图b为鸟枪循环芯片测序法策略2024/5/22024/5/2一个4Mb基因组和3个6Mb基因组测序传统的Sanger测序法：需要好几个月的时间，454测序仪，一位实验人员，包括样品制备等步骤在内所用的时间仅需要一周使用454测序仪还防止了传统测序方法中细菌克隆阶段可能出现的错误，获得了高质量的测序结果发现了导致结核分枝杆菌对R207910产生抗药性的两个点突变位点，此研究成果使得人类最近的40年内第一次找到了特异性治疗结核病的药物2024/5/22007年6月，JamesWatson的基因组序列登录到了GenBank数据库当中，这是第一次使用非Sanger测序法获得了人类个体基因组序列，且第一次将个人基因组序列公之于众整个测序在两个月之内完成，花费不到100万美元，仅占耗时10年之久的人类基因组方案使用经费的千分之一，Venter基因组方案费用的百分之一2024/5/22024/5/2IlluminaSolexa合成测序IlluminaSolexa合成测序根本原理2024/5/2ClonalSingleMoleculeArrays

单分子克隆PrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequence~1000moleculesper~1µmcluster

~1000clustersper100µmsquare~40millionclustersperexperiment2024/5/2ReversibleTerminatorChemistry

可逆终止反响All4labellednucleotidesin1reactionOPPPHNNOOcleavagesitefluor3’blockNextcycleIncorporationDetectionDeblock;fluorremovalODNAHNNOO3’O5’free3’endXOH2024/5/2Sequencing-by-Synthesis(SBS)Cycle1:Addsequencingreagents Firstbaseincorporated Removeunincorporatedbases Detectsignal