重组基因的导入和鉴定

重组基因的导入和鉴定

构建重组体DNA是分子生物学常用技术。它把经过处理的、具有匹配末端的外源片段和载体进行连接,转化感受态细菌后,经生长、筛选或鉴定,获得含目的DNA的转化菌。本章讨论外源重组基因转入受体细胞的方法，及其重组子的鉴定。第2页,共71页，2024年2月25日，星期天

第一节基因转移的方法在确定染色体DNA是遗传的主要载体后的一段较长时间内，人们一直认为虽然生物种类繁多，表型各异，但决定每种生物基因组的DNA是固定的，包括数目固定、位置固定、功能固定的一系列基因。他们的流动性受到十分严格的限制。第3页,共71页，2024年2月25日，星期天随着遗传学研究的深入，人们逐渐发现细菌的结合、转导、转化、转座等现象，在这些事件中存在明显的遗传物质转移，而这种转移与生物繁殖过程中的遗传物质的转移有显著区别。这些现象后来成为基因工程的基因转移技术。可以用于细菌、真菌和动、植物的基因工程体构建。第4页,共71页，2024年2月25日，星期天一、基因转移的物理方法

裸DNA直接注射微粒轰击电穿孔显微注射物理方法第5页,共71页，2024年2月25日，星期天(1)裸DNA直接注射1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长时间，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整合。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。于是，作为一种新的基因治疗手段——核酸免疫技术应运而生。第6页,共71页，2024年2月25日，星期天第7页,共71页，2024年2月25日，星期天第8页,共71页，2024年2月25日，星期天第9页,共71页，2024年2月25日，星期天提高转化效率措施实验表明，横纹肌细胞(如心肌、骨傍肌)和胸腺滤泡细胞摄取DNA的能力较强，但实际上质粒DNA注射入肌组织后，最多只有1％-2％的肌纤维被转染，DNA的转染效率不仅与质粒DNA的大小、构型有关，还与肌细胞的状态有十分密切的关系。人们为提高肌细胞摄取DNA的能力采取了一些措施，如在质粒接种前先给予高渗蔗糖溶液、心肌毒柬或麻醉剂(如利多卡因)的预处理。第10页,共71页，2024年2月25日，星期天(2)基因枪介导的皮内或皮下导入首先利用微小的金、钨等金属颗粒相DNA吸附，然后在高压作用下将DNA伴随金颗粒高速进入细胞，由于微粒的直径一般在0.5-0.9Fm之间，远小于细胞．因此可直接将DNA导入细胞质中，这种方法能有效地使DNA在活体组织、贴壁细胞和悬浮细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量DNA即可获得外源基因的表达并激发有效免疫应答。第11页,共71页，2024年2月25日，星期天

80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。(2)基因枪介导的皮内或皮下导入第12页,共71页，2024年2月25日，星期天(2)基因枪介导的皮内或皮下导入首先将钨、金微粒(直径约0.4μm，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(1～2μl)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。操作技术程序为：第13页,共71页，2024年2月25日，星期天第14页,共71页，2024年2月25日，星期天第15页,共71页，2024年2月25日，星期天基因枪所用材料：（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。（2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。基因枪法的特点：（1）转化效率高。（2）受体广泛。（3）操作简单。第16页,共71页，2024年2月25日，星期天(3)电穿孔(electroperation)

该方法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，使细胞膜上形成纳米大小的微孔，可将DNA转移到细胞中。该方法简便，且有较稳定的转染效率，可广泛运用于培养细胞的基因转移.第17页,共71页，2024年2月25日，星期天原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。第18页,共71页，2024年2月25日，星期天操作程序：将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0度下加高压（2～4KV），电脉冲10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60%～80%。第19页,共71页，2024年2月25日，星期天(4)显微注射指在显微镜下，将DNA由细胞玻璃针直接注入细胞。可以将DNA直接注入核内而减少溶酶体对外源DNA的降解，有助于基因的整合与表达。适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包括原代及传代细胞、胚胎细胞等。第20页,共71页，2024年2月25日，星期天微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头—道进入。真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。(4)显微注射第21页,共71页，2024年2月25日，星期天固定细胞技术显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。常用的细胞固定方法有3种：一、琼脂糖包埋法二、多聚赖氨酸粘连法三、吸管支持法第22页,共71页，2024年2月25日，星期天二、基因转移的化学方法化学方法磷酸钙共沉淀法DEAE—葡聚糖转染法脂质体转染法第23页,共71页，2024年2月25日，星期天(1)磷酸钙共沉淀法当CaCl2、DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将DNA吸收进入细胞质面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。DNA多以多拷贝首尾相连的串珠状排列进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存在。第24页,共71页，2024年2月25日，星期天第25页,共71页，2024年2月25日，星期天该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转移效率最高可达到20％，但长期表达效率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。第26页,共71页，2024年2月25日，星期天(2)DEAE-葡聚糖转染法二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子量的多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，因此被用于基因转染技术。其促进细胞捕获DNA的机制还不清楚，可能是因为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能是葡聚糖与细胞结合面引发了细胞的内吞作用。该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他DNA，适合于细胞瞬间表达检测及小量DNA的转染。第27页,共71页，2024年2月25日，星期天(3)脂质体转染法将磷脂、胆固醇或其他脂类的乙醚溶液加入到DNA溶液中，经特殊处理得到单层或双层的带DNA的脂质体小泡，通过与细胞膜融合，被细胞内吞而实施基因转移。这类方法基因转移效率很高，据报道最高时，100％离体细胞可以瞬时表达外源基因。第28页,共71页，2024年2月25日，星期天三、基因转移的生物方法(一）载体介导质粒Ti质粒--土壤根瘤菌Ri质粒--发根土壤根菌逆转录病毒(Rv)载体腺病毒(Ad)载体腺相关病毒(AAv)载体单纯疱疹病毒(HSv)载体嵌合病毒载体病毒第29页,共71页，2024年2月25日，星期天质粒两种病原土壤杆菌根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根土壤根菌(Agrobacteriumrhizogenes)分别含有Ti和Ri质粒为基因克隆载体介导的基因转移。第30页,共71页，2024年2月25日，星期天第31页,共71页，2024年2月25日，星期天1、共培养法(cocultivation)Marton等1979年以原生质体为受体建立，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。（一）载体介导的转化方法第32页,共71页，2024年2月25日，星期天（1）原生质体共培养法

取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。1、共培养法(cocultivation)第33页,共71页，2024年2月25日，星期天①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。②原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05／ml、农杆菌l07／ml，20℃下保温32小时。③冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mg／L万古霉素，200mg／L羧苄青霉素，200mg／L链霉素)的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。④3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为：第34页,共71页，2024年2月25日，星期天第35页,共71页，2024年2月25日，星期天（2）叶盘共培养法

该方法最早由Horsch(1985)首创，用于烟草转化。优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。第36页,共71页，2024年2月25日，星期天（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养

原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。

第37页,共71页，2024年2月25日，星期天所谓整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养4周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。（4）活体接种(inoculationinvivo)

第38页,共71页，2024年2月25日，星期天2、病毒介导的基因转移

（1）双链DNA病毒转化载体这类病毒是以双链DNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV,CaullinusMozicVirus）。

（2）单链DNA病毒转化载体GeNV顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。（3）单链RNA病毒转化载体迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNA病毒为基因载体的基因转化体系，但是RNA病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒。

第39页,共71页，2024年2月25日，星期天3花粉管通道在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

第40页,共71页，2024年2月25日，星期天4叶绿体基因组转化1990年Svab等利用基因枪轰击法获得烟草叶绿体转基因植株。叶绿体基因组转化技术在外源基因的导入,外源基因的整合与表达,转基因植株的筛选等方面都取得了长足的发展。到目前为止,叶绿体基因组转化技术已在烟草、拟南芥、马铃薯、油菜、番茄和水稻等高等植物中获得了成功。第41页,共71页，2024年2月25日，星期天第二节重组体的筛选与鉴定一、遗传检测法二、物理检测法

三、菌落或噬菌斑杂交筛选法四、免疫化学检测法五、DNA-蛋白质筛选法六、转译筛选法第42页,共71页，2024年2月25日，星期天一、遗传检测法1、根据载体表型特征选择重组体分子

质粒、柯斯载体--抗药性记号或营养记号噬菌体--噬菌斑

第43页,共71页，2024年2月25日，星期天pBR322质粒--四环素抗性基因(tetr)和氨卞青霉素抗性基因(ampr)。将转化的细胞培养在含有四环素或氨卞青霉素的生长培养基中,检测出获得了此种质粒的转化子细胞。第44页,共71页，2024年2月25日，星期天插入失活效应(Insertionalinactivation)检测外源DNA插入的方法在pBR322质粒的DNA序列上有许多种不同的核酸内切限制的识别为位点都可以接受外源DNA的插入。如携带在amprtetr基因的pBR322质粒,当其tetr基因中插人外源DNA片段时，其宿主细胞表型变为amprtets,可以通过这种方法筛选出重组体分子。第45页,共71页，2024年2月25日，星期天插入失活法筛选重组子第46页,共71页，2024年2月25日，星期天半乳糖苷酶显色反应pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。第47页,共71页，2024年2月25日，星期天lacZ’lacZ’N端C端缺陷型大肠杆菌完整的β-半乳糖苷酶第48页,共71页，2024年2月25日，星期天重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记lacZ’

的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第49页,共71页，2024年2月25日，星期天互补显色反应

第50页,共71页，2024年2月25日，星期天2根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法外源基因能够表达，可以根据表型特征的直接选择。基本原理：转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。第51页,共71页，2024年2月25日，星期天例如，编码大肠杆菌生物合成基因克隆的外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株不可逆的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性，我们便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。目前已拥有相当数量的对其突变作了详尽研究的大肠杆菌实用菌株。而且其中有许多种类型的突变，只要克隆的外源基因产物获得低水平的表达，便会破抑制或发生互补作用。应用类似的方法成功地分离了小鼠的二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因。第52页,共71页，2024年2月25日，星期天这种筛选法受一定的条件限制，它不单要求克隆的DNA片段必须大到足以包含一个完整的基因序列，而且还要求所编码的基因应能够在大肠杆菌寄主细胞中实现功能表达。无疑，真核基因是难以满足这些要求的。其原因在于有许多真核基因是不能同大肠杆菌的突变发生抑制作用或互补效应的。此外，大多数的真核基因内部都存在着间隔序列，而大肠杆菌又不存在真核基因转录加工过程中所需要的剪辑机理，这样便阻碍了它们在大肠杆菌寄主细胞中实现基因产物的表达，当然，在有些情况下可以通过使用mRNA的cDNA拷贝构建重组体DNA的办法，来克服这类问题。第53页,共71页，2024年2月25日，星期天在利用λ噬菌体载体筛选重组体时，主要依赖重组DNA的大小及形成噬菌斑的能力，只有当重组体DNA是野生型λDNA的75％-l05％的长度时，才能在培养平板上形成“清晰的噬菌斑”，而单一载体DNA是不会包装成活的噬菌体颗粒的。经体外包装及转导后能否形成清晰的噬菌斑，尤其是对替换型λ噬菌体载体，本身就是一种可利用的选择标记。第54页,共71页，2024年2月25日，星期天二、物理检测法

1凝胶电泳检测法证明重组体质粒在分子量上的增加,一种直截了当的方法是分离质粒的DNA并测定其分子长度。对此。电子显微镜测定无疑是有效的方法，但对于以筛选为目的实验来说,则显得过于烦琐。因此,常用操作程序比较简单的凝胶电泳测定法来代替。第55页,共71页，2024年2月25日，星期天带有外源DNA插入序列、分子量较大的重组体DNA在凝胶中的迁移速率，比不具有外源DNA插入序列、分子量较小的质粒DNA来得缓慢些。根据这种差别就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有外源DNA插入序列的分子量较大的重组质粒。第56页,共71页，2024年2月25日，星期天物理检测法

凝胶电泳检测法第57页,共71页，2024年2月25日，星期天2R环检测法采用mRNA作探针的核酸杂交法，来检测具有外源DNA插入片段的重组体分子。一种是R-环检测法，另一种是放射性探针检测法。第58页,共71页，2024年2月25日，星期天在临近双链DNA变性温度下和高浓度(70％)的甲酰胺溶液中,双链的DNA-RNA分子稳定。第59页,共71页，2024年2月25日，星期天这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体,叫做R-环结构。可以在电子显微镜下观察到。可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。使待检测纯化的质粒DNA，在含mRNA分子的缓冲液中局部的变性。如果质粒DNA分子上存在着与mRNA探针互补的序列，那么这种mRNA就将取代DNA分子中的相应的互补链，形成R-环结构。然后放置在电子显微镜下观察,这样使可以检测出重组体质粒的DNA分子第60页,共71页，2024年2月25日，星期天三、菌落或噬菌斑杂交筛选法核酸杂交检测法：应用放射性标记的特定的DNA或RNA作探针，进行DNA/DNA或DNA／RNA杂交。最早由M.Grunstein和D.Hogness(1975)发明应用放射性标记的探针原位筛选重组体菌落的方法。经过D.Hanahan和M.Meselson(1980)的改良可适用于高密度的菌落杂交筛选。第61页,共71页，2024年2月25日，星期天菌落原位杂交是先将要筛选的菌落影印到平板表面的硝酸纤维素滤膜上，继续培养至生长出菌落，取出长有菌落的滤膜，用碱处理裂解菌体，再将膜用蛋白酶K处理以除去蛋白质。在80℃烘烤膜以固定DNA，最后用探针进行杂交，并参照放射自显影底片上的曝光点，从平板上的相应位置挑出阳性菌落。第62页,共71页，2024年2月25日，星期天例：原位杂交筛选重组体菌落(或噬