防疫物资采购新冠病毒检测试剂盒性能方案

第一节新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒 1一、原理 1二、抗体检测优势 2三、分类 2四、检测原理（以IgM抗体为例） 2五、各种检测方法的特点 4六、适用范围 4七、操作步骤（以国械注准20203400240为例） 4八、标本运输 5九、临床意义 6第二节新冠病毒核酸检测试剂 6一、新冠病毒核酸检测方法 6二、新冠病毒核酸检测实验室生物安全要求 7三、新冠病毒核酸检测结果 8四、新冠病毒核酸检测流程 9第一节新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒一、原理新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒用于快速定性检测人类全血、血清、血浆中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体，最快可在15分钟内肉眼观察获得检测结果。二、抗体检测优势1.与核酸联合检测提高检出率。2.采样的问题可能使核酸检测出现假阴性的情况，抗体检测采样较均一。3.抗体检测有效帮助提高疑似病例的确诊率。4.实验室要求低，利于各级医院广泛展开。5.流行病学研究提供支持数据。三、分类按检测原理不同分为以下四类：1.新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）2.新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）3.新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）4.新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒（化学发光法）四、检测原理（以IgM抗体为例）1.胶体金法（以间接法为例）新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒（胶体金法）的检测原理是胶体金标记鼠抗人IgM，同时硝酸纤维素膜上包被新型冠状病毒抗原，利用胶体金免疫层析间接法的原理达到检测人血清中新型冠状病毒IgM抗体的目的。2.荧光免疫层析法新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）的原理是基于干式荧光标记技术和免疫层析技术，采用全血、血清或血浆作为样本，配套全自动荧光免疫定量分析仪，全自动穿刺进样，实现“样本进、结果出”，最大程度避免产生气溶胶，降低对操作者和环境污染风险。3.酶联免疫法（以捕获法为例）新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的原理是应用捕获酶联免疫吸附分析法，采用抗人IgM单克隆抗体包被反应板，加入校准品或稀释后的样品，样品中的病毒IgM抗体与已包被的单克隆抗体结合形成抗人IgM抗体-IgM抗体复合物，洗涤后加入HRP标记的2019-nCoVN蛋白抗原（E蛋白抗原或S蛋白抗原），形成抗人IgM抗体-IgM抗体-2019-nCoVN蛋白抗原-HRP复合物。洗板后加入TMB底物，复合物上连接的HRP催化底物生成蓝色物质，加入终止液后变成黄色，在450nm波长处有特异吸收峰。通过峰值高低对人血清中的2019-nCoVIgM抗体进行定性检测。4.化学发光法（以间接法为例）新型冠状病毒抗体检测试剂盒（化学发光法）的原理是高科技材料磁珠标记病毒的重组蛋白，用于结合血液样本中的病毒抗体IgM，再使用二抗来识别抗体。二抗上面偶联了碱性磷酸酶，加入底物后会产生光信号，化学发光仪器通过高灵敏度的PMT（光电倍增管）来检测光子，从而实现pg(皮克)级别的高灵敏度检测。五、各种检测方法的特点胶体金法操作便捷，可直接目视判读，一般15分钟左右即可完成检测；免疫荧光层析法与胶体金法一样操作便捷，检测迅速，但需要仪器判读；酶联免疫法可采用常规酶标仪判读，一般灵敏度较高，但检测时间较长（约1.5小时左右），而且操作步骤较多，操作过程中应采取措施避免感染。化学发光法一般灵敏度亦较高，采用全自动化学发光免疫分析仪，无需过多手工操作即可完成检测，检测时长一般约半小时。六、适用范围用于体外定性检测人血清、血浆和静脉全血样本中新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体。仅用作对新型冠状病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用，不能作为新型冠状病毒感染的肺炎确诊和排除的依据，不适用于一般人群的筛查。仅限医疗机构使用。七、操作步骤（以国械注准20203400240为例）1.取出试剂盒，室温平衡20~30分钟。2.滴加血清或血浆样本10μL，滴加全血样本20μL于反应孔中，待液体充分吸入。3.滴加样本稀释液2滴于反应孔中，待液体充分吸入。4.1-15分钟可判读结果。阳性结果：检测开始后1-15min，检测卡C线和T线位置均出现条带。阴性结果：15min内仅有检测卡C线位置出现条带，T线位置不出现条带。无效结果：15min内检测卡C线和T线位置均不出现条带或仅T线位置出现条带，C线位置不出现条带。八、标本运输1.院内运输包装：标本采集后用1000mg/L含氯消毒液对标本容器外表面进行擦拭或喷洒消毒，然后放入带有生物安全警示标识的专用标本自封袋中包装，并对自封袋外表面用1000mg/L含氯消毒液进行消毒，然后置于专用密闭转运箱，并对转运箱外表面用1000mg/L含氯消毒液消毒。运送：由经过生物安全培训的专人运送至实验室，运送人员应佩戴帽子、一次性外科口罩、手套、隔离衣，转运期间保持转运箱平稳，避免剧烈震荡、颠簸。2.院外运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部令第45号）要求执行。依据国家《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》标准，新型冠状病毒毒株及其他潜在感染性材料的运输包装分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装材料应符合PI602分类包装要求。九、临床意义1.IgM、IgG类抗体是人体感染新冠病毒后产生的免疫防御蛋白，IgM抗体产生早，一经感染，快速产生，维持时间短，消失快，血液中检测阳性可作为早期感染的指标，可用于感染的早期辅助诊断。2.IgG抗体产生晚，维持时间长，消失慢，血液中检测阳性可作为感染和既往感染的指标。3.血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”为确诊病例的血清学依据。第二节新冠病毒核酸检测试剂一、新冠病毒核酸检测方法采用RT-PCR检测技术。根据国家卫生健康委员会发布的新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南，在实验室要确认一个病例为阳性，需满足同一份标准中新冠病毒的ORF1ab及N基因2个靶标特异性RT-PCR检测结果均为阳性，或单靶标阳性患者重新采样/另一类型样品检测仍为单靶标阳性，故实验室针对新冠病毒的核酸检测应至少包含最为保守及特异的ORF1ab区域以及N基因。二、新冠病毒核酸检测实验室生物安全要求1.实验室及检验人员生物安全自新冠肺炎疫情爆发以来，各医院检验科面对新冠病毒检测量增加、确诊/疑似病例和普通患者的标本不易区分、实验室空间限制、生物安全防护物资不足等各类问题，临床实验室特别是进行新冠病毒核算检验的科室的生物安全防护措施尤为关键。目前国家卫生健康委员会对新冠病毒暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，根据最新版的新冠病毒实验室检测指南及实验室生物安全指南，如无法对原始样本进行可靠的灭活，则对其进行的核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护(建议至少穿戴工作服、一次新工作帽、双层手套、医用一次性防护服、医用防护口罩或动力送风过滤式呼吸器、防护面屏或护目镜、工作鞋或胶鞋、防水靴套)，各实验室还可根据自身情况增加进一步的防护；同时标准预防、不定期通风和手卫生等重要的防护措施必不可少。2.原始样本的灭活及对核酸检测的影响新冠病毒实验室检测指南中未对原始样本的有效灭活条件进行规定或建议，在目前最新的新冠病毒核酸检测专家共识中，建议采用56℃水浴45min，并可根据提取试剂在标本裂解时所采用的温度调整灭活温度，但不低于56℃，此条件是依据以往对MERS等病毒灭活条件的研究。同时专家共识也建议各实验室对原始样品的灭活条件有预实验结果的支持。由于目前常见样本类型的新冠病毒核酸阳性检出率仍不高，故任何可能降低病毒核酸提取效果及检出率的因素，如样本灭活条件及灭活时间等均应引起重视。此前，华中科技大学附属同济医院检验科的专家学者对PCR检测病毒核酸(以乙型流感病毒为例)进行了相应的小样本量比对，结果发现未灭活处理、56℃水浴30min，及50℃干预1h的同一样本其PCR检测阳性结果的扩增曲线CT值无明显变化，可作为新冠病毒样本灭活的参考。根据笔者所在研究团队20例新冠病毒感染者的同一样行样本分别进行56℃干浴30min及65℃干浴30min后，其PCR检测的阳性CT值无明显差异(P>0.05)，该研究结果尚未发表。三、新冠病毒核酸检测结果1.不同样品类型中新冠病毒的核酸检测在临床上的新冠病毒疑似病例分别采集不同类型呼吸道样品进行核酸检测，结果初步提示在新冠病毒感染中，取咽拭子样本及深部痰样本的病毒核酸检出率之间有明显差异，咽拭子样品中新冠病毒阳性检出率低于深部咳痰。2.不同呼吸道样本取样材料对新冠病毒核酸检测结果的影响在确诊患者中对比了带病毒保存液的植绒拭子样本及无病毒保存液的普通棉签拭子样本的新冠病毒核酸检测结果，发现普通棉签拭子的核酸检出率明显低于带病毒保存液的植绒拭子(P<0.05)。3.讨论根据目前最新版新冠病毒诊疗指南、防控方案及实验室检测专家共识，对新冠病毒的核酸检测均应至少检测ORF1ab及N基因(或E基因)，检测的通道同时阳性时判定为阳性，并均踢打阴性结果不能排除新冠病毒感染，应考虑各环节中导致假阴性的原因。同时在第五版实验室检测技术指南中，对于单通道阳性结果，不仅要求重新采样及检测，对结果判定也增加了新的要求，即重新检测结果仍为单通道阳性时，判定heUS那检测结果为阳性；同时增加了2种类型样本均检测得到单靶标阳性结果时，应判定核酸检测结果为阳性。四、新冠病毒核酸检测流程1.试剂配制根据待测样本数量+2人份（空白对照和阳性对照）配制试剂：（2019-nCoV-PCR反应液26μl/人份+2019-nCoV-PCR-酶混合液4μl/人），充分混匀成PCR混合液，每一反应管分装30μl配制好的PCR混合液。2.核酸提取（1）取出样本