dna复制和损伤医学知识讲座

dna复制和损伤医学知识讲座dna复制和损伤医学知识讲座第1页DNA复制是一个由各种酶催化和有各种蛋白质参加受到精密调控过程；

§3-1DNA复制概貌DNA是细胞中唯一具修复系统生物大分子。dna复制和损伤医学知识讲座第2页1958年Meselson和Stahl研究了经15N标识几代大肠杆菌DNA，首次证实了DNA复制半保留性。

一、DNA复制半保留性(Semiconservativereplication)

dna复制和损伤医学知识讲座第3页二、DNA半不连续复制DNAsynthesisissemidiscontinuousdna复制和损伤医学知识讲座第4页（一）起点（原点origin）三、复制起点、方向（即次序性及复制单位）

replicationorigin&directiondna复制和损伤医学知识讲座第5页许多试验证实，DNA复制是由固定起始点开始。E.coli染色体复制原点oriC成串排列3个13bp重复序列(GATCTNTTNTTTT)反向重复出现4个9bp序列(TTATCCACA)dna复制和损伤医学知识讲座第6页复制子（replicon）普通把生物体独立复制单位称为复制子。一个复制子只含有一个复制起点。即能开启DNA复制开始基因组上DNA次序，包含复制原点和引发复制结构基因，以及在其控制下DNA区段统称为复制子。dna复制和损伤医学知识讲座第7页5’OHTCApppOHCTCA

C5’

OH3’+ppi（二）子链DNA延伸方向

新链合成只能从5’

到3’

方向dna复制和损伤医学知识讲座第8页不一样细胞复制参数

原核生物（大肠杆菌）真核生物（人）细胞内复制子数目（个）1（1）多个（103～104）复制子平均长度（kb）3～9×106约105～106复制方向多为双向多为双向复制速度(bp/s/复制叉)等速（850）等速（60～90）dna复制和损伤医学知识讲座第9页§3-2DNA复制酶和相关蛋白一、DNA聚合酶DNAPolymerase特点：1.以4种dNTP为底物；2.反应需要接收模板指导；3.反应需要有3’-OH存在；4.DNA链合成方向为5’3’；5.产物DNA性质与模板相同。dna复制和损伤医学知识讲座第10页dna复制和损伤医学知识讲座第11页(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一个多功效酶。包含：5’3’聚合酶活性。3’5’核酸外切酶活性。5’3’核酸外切酶活性。从3′端将DNA链水解，DNA校对（proofreading）功效。从5′端将DNA链水解，DNA修复功效。将dNTP加到DNA链3′-OH上，DNA聚合功效。dna复制和损伤医学知识讲座第12页dna复制和损伤医学知识讲座第13页klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理能够将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。较大C末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，含有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，常见做体外合成DNA工具酶。切口平移：DNA聚合酶I5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤部位，DNA聚合酶I5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nicktranslation）。在DNA复制中，RNA引物切除；DNA损伤修复；在体外，制备高放射性活性DNA探针。dna复制和损伤医学知识讲座第14页(二)DNA聚合酶Ⅲ

多亚基不对称二聚体结构(10种亚基)

1.α亚基、ε亚基和θ亚基相连组成关键酶（coreenzyme）α亚基含有5′→3′聚合酶活性.ε亚基含有3′→5′外切酶活性.

θ亚基可能起组建作用.dna复制和损伤医学知识讲座第15页2.DNA聚合酶Ⅲ含有连续合成能力.β亚基功效如同夹子:提升了酶连续合成能力.

夹子装置器（clamploader）:两个γ亚基与另4个亚基（δ亚基、δ′亚基、χ亚基、ψ亚基）组成γ复合物，其主要功效时帮助β亚基夹住DNA，故称夹子装置器。γ亚基是一个依赖于DNAATP酶

τ亚基起促使关键酶二聚化作用

dna复制和损伤医学知识讲座第16页二、DNA旋转酶(DNAGyrase)DNA旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋,可去除解螺旋产生扭曲张力.并依赖于β亚基催化ATP水解,以使酶构象复原.DNA旋转酶抑制剂如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制细菌合成.dna复制和损伤医学知识讲座第17页三、DNA解旋酶(DNAHelicase)和单链结合蛋白(Single-strandDNAbindingprotein,SSB)1.DNA解螺旋酶是利用ATP水解取得能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动一类酶总称。预防核酸水解酶作用

防止解开单链DNA重新缔合形成双链对单链DNA有很高亲和性

它们与DNA结合时有协同作用2.单链结合蛋白（SSB）：dna复制和损伤医学知识讲座第18页

RNA聚合酶

[RifS]完成对先导链引物合成

实现DNA复制转录激活起始引发酶

[RifR]

完成对后随链引物合成

较先导链开启落后一个Okazaki片断

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII进行DNA链延伸

四、引发酶(Primerase)dna复制和损伤医学知识讲座第19页酶-AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处5′磷酰基团，以焦磷酸形式活化，形成AMP-P-DNA。五、连接酶(Ligase)DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口3′-OH与5′-P酰基形成磷酸酯键。酶活化经过相邻DNA3′-OH对活化P原子进行亲核攻击，生成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放出AMP。

催化过程：

腺苷酰化DNA亲核攻击完成DNA连接需要NAD+或ATP提供腺苷酰基（AMP），与酶活性中心赖氨酸残基ε-NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶-AMP；

。

dna复制和损伤医学知识讲座第20页§3-3DNA复制过程一、E.coliDNA复制（环型双股DNA，双向θ方式）分为三个阶段：起始、延伸和终止复制体（Replisome）：在DNA合成生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制相关酶和蛋白质因子，它们组成复合物称为复制体。DNA复制阶段表现在于复制体结构改变。dna复制和损伤医学知识讲座第21页dna复制和损伤医学知识讲座第22页2.复制终止1.环行E.coli染色体上两个复制叉相遇在排列有许多重复拷贝Ter序列（长约22bp）一个终止区域（terminus），并停顿复制。2.称为Tus(terminusutilizatlconsubstance，终点利用物质）蛋白质结合于Ter序列，Tus_—Ter复合物只能够阻止一个方向复制叉。3.E.coli分开连锁体需要拓扑异构酶Ⅳ（属于类型Ⅱtopo酶）参加作用。分开两闭合环。dna复制和损伤医学知识讲座第23页二、滚环复制（rollingcirclereplication）ΦX174基因组DNA是单链环型DNA，复制中首先合成其互补链（而非其本身），形成复制型（replicationform,RF），然后进行滚环型（roollingcircle）复制。滚环复制是在一条断裂亲本链3‘_OH上不停地发生DNA聚合物作用，因而也叫共价延伸（covalenceelongation

）。

dna复制和损伤医学知识讲座第24页三、D环复制（displacement

replication）线粒体DNA双股链分为轻链和重链。它复制是一个单向不对称特殊复制方式,称为Ｄ—环复制。复制从重链（Ｈ链）原点开始，新合成Ｈ链置换原来链，游离单链称为取代链（displacement）或Ｄ环。当Ｈ链合成进行到约2/3时，轻链（Ｌ链）原点暴露出来，并引发其合成，延伸方向与Ｈ链相反。dna复制和损伤医学知识讲座第25页四、真核生物复制特点（一）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制相同点。（二）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制不一样点：１．真核DNA有多个复制原点；2．真核生物染色体在全部复制完成之前不能再重新开始复制，而在快速生长原核生物中起点能够连续发动复制。3．真核生物复制调控远比原核生物更为复杂。4．真核生物有各种聚合酶。dna复制和损伤医学知识讲座第26页从哺乳动物中分出５种DNApol酶。分别为polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亚基）：有引物合成酶活性。含有合成RNA后4~5dNTP活性。无外切酶活性。连续性中等，约为100核苷酸，完成滞后链DNA复制。Polδ（2亚基）：有连续合成DNA链能力，有3'—5'核酸外切酶活性（含有校正功效），完成前导链DNA复制。

Polε（>1亚基）：相当于E.colipolⅠ，是一个修复酶，含有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亚基）：与损伤修复相关。Polγ（2亚基）：是线粒体DNA合成酶（3'→5'外切酶）

dna复制和损伤医学知识讲座第27页五、真核生物端粒复制dna复制和损伤医学知识讲座第28页●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCCAACCCC

AACCCC5’(richCchain)

G链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’端粒酶(tolomerase)催化过程dna复制和损伤医学知识讲座第29页七、DNA复制忠实性1.DNA复制是按碱基互补配正确标准进行。

2.DNA聚合酶本身含有校正功效。

5.DNA错配校正和修复系统确保DNA复制忠实性。3.RNA引物存在与去除有利于降低错配率。

4.DNA聚合酶催化反应机制，即DNA聚合酶仅催化5'→3'方向反应。dna复制和损伤医学知识讲座第30页§3-4DNA损伤及修复一、DNA损伤DNA损伤是指正常DNA分子化学结构或物理结构在一些物理、化学原因（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生基因毒素等干扰作用下发生改变现象。（P221）（一）物理原因如电离辐射：使链断裂、碱基及五碳糖损伤。紫外照射（254nm）：使DNA分子相邻2个T形成二聚体（环丁基二聚体）；（二）化学原因1.烷基化

2.亚硝基

3.碱基类似物4.吖啶类分子，如EBdna复制和损伤医学知识讲座第31页（三）自发性损伤1.脱嘌呤和脱嘧啶(AP位点产生)2.碱基脱氨基作用3.碱基互变异构4.细胞正常代谢产物对DNA损伤dna复制和损伤医学知识讲座第32页二、DNA损伤修复（一）错配修复1.模板区分机制催化酶：Dam甲基化酶发生时制：DNA复制后一段时间内（约几秒或几分钟）发生部位：GATC中腺嘌呤N6位置均能够发生甲基化。dna复制和损伤医学知识讲座第33页2.修复位点识别MutS结合在错配位点，MutH结合于GATC次序；MutL能够与MutS形成复合物，并与MutH结合，在错配碱基两边DNA链沿着复合物移动是等速，穿过MutL—MutS复合物产生一个DNA环，直到复合物碰上甲基化GATC次序。MutH催化切断GATC次序G碱基5‘一边未甲基化链，给该修复链作上记号。dna复制和损伤医学知识讲座第34页3.修复切割与聚合(1)当错配点在切点5'端时，去甲基化以3'→5'方向降解（从切点→错配点）。这个过程要有：

DNA解螺旋酶Ⅱ、SSB、

­外切酶Ⅰ或Ⅹ（由3‘→5’方向降解）、DNA聚合酶Ⅲ、DNA连接酶。

(2)错配点在切点3'端一边时，修复路径类似。外切酶Ⅶ（5'→3'或3'→5'方向降解）、或RecJ蛋白（5'→3'方向降解单链DNA）。dna复制和损伤医学知识讲座第35页（二）切除修复（excisionrepair）

1.碱基切割修复（baseexcisionrepair）（1）由细胞内一类特异DNA糖苷酶（glycosylase）识别DNA中不正常碱基，并将其水解下来，形成AP位点。

（2）AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。（不一样AP核酸内切酶作用方式不一样，或是在5'侧切开，或是在3'侧切开）。

（3）核酸外切酶将包含AP位点在内DNA链切除。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以填补空缺，DNA连接酶将连上。dna复制和损伤医学知识讲座第36页AP位点产生dna复制和损伤医学知识讲座第37页2.核苷酸切除修复（nucleotide-excisionrepair）切除酶（excinuclease）也是一个核酸内切酶，但与普通核酸内切酶不一样，在链损伤两侧同时切开。编码此酶基因是Uvr基因。大肠杆菌中ABC切除酶催化过程：①UvrA和UvrB复合物（A2B）寻找并结合到损伤部位。②UvrA离解，UvrB与DNA牢靠结合。③UvrC蛋白结合到UvrB，UvrB切开损伤部位3'端第5个磷酸二酯键，UvrC切开5'侧第8个磷酸二酯键。④UvrD解螺旋酶帮助除去。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补。dna复制和损伤医学知识讲座第38页（三）直接修复（directrepair）

直接修复是指不需要移去任何碱基或核苷酸就能够将损伤逆转到正常状态修复机制。（P229）1.光复活修复（potoreactivationrepair）

2.O6—甲基鸟嘌呤修复光复活(photoreactivation)是在可见光(300～600nm)活化之下，光复活酶(photoreactivatingenzyme，PR)，或称光敏裂合酶(photolyase)，催化嘧