化学成分研究方法省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

2.2.2中药有效成份分离与精制

本节介绍中药化学成份普通分离方法，有萃取、沉淀、结晶、色谱等方法。重点掌握中草药有效成份分离方法原理及规律。

物质分离许多操作往往在溶液中进行。实践中能够采取以下方法：

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1.结晶及重结晶法

利用不一样温度可引发物质溶解度改变性质来分离物质。关于结晶和重结晶概念：结晶是指由非结晶状态到形成结晶操作过程。重结晶指由纯度低结晶处理成纯度高结晶操作过程。二者从操作角度差异是起始物不一样。2第2页（一）依据物质溶解度差异进行分离

判断结晶纯度方法。（1）晶型均一，色泽均匀。（2）有一定熔点和较小熔距，熔距应在2度以内。（3）TLC或PC分别用三种以上溶剂系统检识，同单一圆整斑点。（4）HPLC或GC检验展现单峰。

3第3页（一）依据物质溶解度差异进行分离结晶和重结晶操作：

提取或分离物↓溶于选择溶剂，加热成饱和溶液，过滤溶液↓放置（冷藏）析晶，过滤粗结晶↓重复上述操作（重结晶）结晶4第4页（一）依据物质溶解度差异进行分离

选择结晶溶剂标准是：

对要结晶成份热时溶解度大，冷时溶解度小，对杂质冷热都不溶或冷热都易溶；

另外要求结晶溶剂不与待结晶物质发生化学反应；

沸点较低、易挥发；

无毒或毒性很小。

选择溶剂依据“相同相溶”原理。5第5页（一）依据物质溶解度差异进行分离

2.沉淀法（溶剂沉淀法）

在溶液中加入另一个溶剂以改变混合极性，使一部分物质沉淀析出。从而实现分离。如：水提醇沉法（除去多糖或蛋白质）；醇提水沉法（除去树脂或叶绿素）；醇提乙醚沉淀或丙酮沉淀法（使皂苷沉淀析出）

6第6页（一）依据物质溶解度差异进行分离水提醇沉法系指处方中药材加水煎煮，既提取出有效成份，如：生物碱盐、甙类、有机酸类、氨基酸、多糖类等；同时也提出一些水溶性杂质，如：淀粉、蛋白质、粘液质、鞣质、色素、无机盐等。若往水煎液中加入适量乙醇，能够改变其溶解性能而将杂质部分或全部除去。当乙醇浓度到达60%～70%时，除鞣质、树脂等外，其它杂质已基本上沉淀而除去。假如分2～3次加入乙醇，浓度又逐步提升，最终到达75%～80%，则除去杂质效果更加好。

7第7页（一）依据物质溶解度差异进行分离醇提水沉法系指将中药原料用一定浓度乙醇用渗漉法、回流法提取，即可提取出生物碱及其盐、甙类、挥发油及有机酸类等；即使多糖类、蛋白质、淀粉等无效成份不易溶出，但树脂、油脂、色素等杂质却仍可提出。为此，醇提取液经回收乙醇后，再加水处理，并冷藏一定时间，可使杂质沉淀而除去。40%～50%乙醇可提取强心甙、鞣质、蒽醌及其甙、苦味质等；60%～70%乙醇可提取甙类；更高浓度乙醇则可用于生物碱、挥发油、树脂和叶绿素提取。

8第8页（一）依据物质溶解度差异进行分离

3.pH法：对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可经过加入酸、碱以调整溶液pH值，改变分子存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。

酸提碱沉法（使生物碱类成份沉淀）。碱提酸沉法（使黄酮、蒽醌等沉淀）；等电点法（使蛋白质沉淀）

9第9页（一）依据物质溶解度差异进行分离4.金属盐沉淀法：酸性或碱性化合物还可经过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性盐类等沉淀析出。10第10页（一）依据物质溶解度差异进行分离

铅盐沉淀法：利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶铅盐或络盐沉淀而分离方法。中性醋酸铅可沉淀含有邻二酚羟基和羧基成份；碱式醋酸铅沉淀范围较广，可沉淀含酚羟基和羧基及中性皂苷等。如沉淀为杂质，则可弃去；如沉淀为所要成份，则可将沉淀悬浮于水或稀醇中，通H2S气体或加入稀H2SO4、Na2SO4等脱铅，成份即可分离。

11第11页（一）依据物质溶解度差异进行分离专属试剂沉淀法:一些试剂能选择性地沉淀某类成份，称为专属试剂沉淀法。如雷氏铵盐能与水溶性生物碱类生成沉淀，可用于分离水溶性生物碱与其它生物碱；胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离；明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质等。12第12页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

常见方法有:简单液．液萃取法、

逆流分溶法

(CCD)、液滴逆流色谱法(DCCC)、高速逆流色谱(HSCCC).

13第13页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离1．液一液萃取与分配系数K值将两种相互不能任意混溶溶剂(比如氯仿与水)置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。此时假如其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中分配比(K)在一定温度及压力下为一常数，能够用下式表示：

14第14页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离K：表示分配系数；CU：表示溶质在上相溶剂中浓度；CL：表示溶质在下相溶剂中浓度。现在假定有A、B两种溶质用氯仿及水进行分配，如A、B重量均为1.0g，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比VCHCl3／VH20=1，则用分液漏斗作一次振摇分配平衡后，约90％溶质A将分配在上相溶剂(水)中，约10％溶质A则分配到下相溶剂(氯仿)中。同理，KB=0.1=1／10，在振摇平衡后，则溶质B分配将与A相反。留在水中约为10％，约90％分配在氯仿中。这说明，在上述条件下，A、B两种溶质在氯仿及水中仅作一次分配就可实现90％分离。15第15页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离2．分离难易与分离因子β现在，我们能够用分离因子β值来表示分离难易。分离因子β可定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数比值。

即：

上例中，β=KA／KB=10／0.1=100。16第16页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离就普通情况而言，β≥100，仅作一次简单萃取就可实现基本分离；但100>β≥10，则需萃取10～12次；β≤2时，要想实现基本分离，须作100次以上萃取才能完成；β≌1时，则KA≌KB，意味着二者性质极其相近，即使作任意次分配也无法实现分离。而实际分离工作中，我们总是希望选择分离因子β值大溶剂系统，以求简化分离过程，提升分离效率。17第17页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

3．分配比与pH对酸性、碱性及两性有机化合物来说，分配比还受溶剂系统pH影响。因为pH改变能够改变它们存在状态(游离型或离解型)，从而影响在溶剂系统中分配比。以酸性物质(HA)为例，其在水中离解平衡及离解常数K可用下式表示：18第18页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离两边取负对数则：19第19页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离Ka及pKa均可用来表示酸性物质酸性强弱。酸性越强，Ka越大，pKa值越小。若使该酸性物质完全离解，即使HA均转变成A一则：

故：20第20页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离因为酚类化合物pKa值普通为9．2～10．8，羧酸类化合物pKa值约为5，故pH3以下大部分酚酸性物质将以非离解形式(HA)存在，易分配于有机溶剂中；而pH12以上时，则将以离解形式(A一)存在，易分配于水中。21第21页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离我们也能够由文件上给出pKa值求出各碱性物质呈游离型或离解型时pH条件。普通pH<3时，酸性物质多呈非离解状态(HA)、碱性物质则呈离解状态(BH+)存在；但pH>12，则酸性物质呈离解状态(A-)、碱性物质则呈非离解状态(B)存在。据此，可采取下列图所表示在不一样pH缓冲溶液与有机溶剂中进行分配方法，使酸性、碱性、中性及两性物质得以分离。22第22页

缓冲液：当往一些溶液中加入一定量酸和碱时，有妨碍溶液pH改变作用，称为缓冲作用，这么溶液叫做缓冲溶液。弱酸及其盐混合溶液（如HAc与NaAc），弱碱及其盐混合溶液（如NH3·H2O与NH4Cl）等都是缓冲溶液。

缓冲溶液作用原理和pH值

由弱酸HA及其盐NaA所组成缓冲溶液对酸缓冲作用，是因为溶液中存在足够量碱A-缘故。当向这种溶液中加入一定量强酸时，H离子基本上被A-离子消耗：

缓冲溶液pH值几乎不变；当加入一定量强碱时，溶液中存在弱酸HA消耗OH-离子而妨碍pH改变。

23第23页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离利用pH梯度萃取分离物质模式图24第24页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

4．逆流分溶法(CCD)液一液萃取分离中经常碰到情况是分离因子β值较小，故萃取及转移操作常须进行几十次乃至几百次。此时简单萃取已不能满足需要，而要采取逆流分溶法(countercurrentdistribution，简称CCD)。25第25页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离CCD法分离过程示意图26第26页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离Craig逆流分溶仪萃取单元

27第27页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离逆流分溶仪萃取单元工作过程

28第28页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离CCD法因为操作条件温和、试样轻易回收，故尤其适于中等极性、不稳定物质分离。另外，溶质浓度越低，分离效果越好。不过，试样极性过大或过小，或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采取此法分离。易于乳化萃取溶剂系统也不宜采取。29第29页乳化概念：

乳化是液-液界面现象，两种不相溶液体，如油与水，在容器中分成两层，密度小油在上层，密度大水在下层。若加入适当表面活性剂在强烈搅拌下，油被分散在水中，形成乳状液，该过程叫乳化。（假如发生乳化，难以分离）（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离30第30页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离5．液一液萃取与纸色谱分离因子β是液．液萃取时判断物质分离难易主要参数。普通β>50时，简单萃取即可处理问题，但β<50时，则宜采取逆流分溶法。问题是对于未知成份组成混合物来说，不知道混合物中各个组分在同一溶剂系统中分配比又怎样求得β值呢?这里能够借助纸色谱(PC)帮助。已知PC原理与液-液萃取法基本相同，Rf值与分配系数K之间有以下关系：31第31页32第32页r为纸层色谱定数。当色谱滤纸湿重(W湿)为干重(W干)1．5倍时，r=2。设A、B两种(或两组)物质Rf值分别为Rfa及Rfb，则

其中Rfa>Rfb据此，可用PC选择设计液．液萃取分离物质最正确方案33第33页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离6．液一液分配柱色谱逆流分溶法分离物质在分液漏斗中或Craig逆流分溶仪中进行时，前者手工操作，比较费时；后者因仪器本身问题，在振摇时轻易引发破损及漏液，又因溶剂消耗量大，振摇过程中又易于乳化，故现在已极少应用，多改用其它装置。如将两相溶剂中一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混溶另一相溶剂(流动相)冲洗色谱柱。这么，物质一样可在两相溶剂中相对作逆流移动，在移动过程中不停进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液．液分配柱色谱法。34第34页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离(1)正相色谱与反相色谱：液一液分配柱色谱用载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。通常，分离水溶性或极性较大成份如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时，固定相多采取强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂，称之为正相色谱；但当分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时，则两相能够颠倒，固定相可用石蜡油，而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂，故称之为反相分配色谱(reversephasepartitionchromatography)。35第35页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离除色谱柱外，液一液分配色谱也可在色谱用硅胶薄层色谱上进行。所以液．液分配柱色谱最正确分离条件能够依据对应薄层色谱结果(正相柱用正相板，反相柱用反相板)进行选定。36第36页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

惯用反相硅胶薄层色谱及柱色谱填料系将普通硅胶经以下方式进行化学修饰，键合上长度不一样烃基(R)形成亲脂性表面而成。37第37页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

依据烃基(-R)长度为乙基(-C2H5)还是辛基(-C8H17)或十八烷基(-C18H37)，分别命名为RP(reversephase)-2、RP-8及RP-18。

三者亲脂性强弱次序以下：RP-18>RP-8>RP-2。38第38页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离(2)加压液相柱色谱：经典液一液分配柱色谱中用载体(如硅胶)颗粒直径较大(1OO～150μm)，流动相仅靠重力作用自上而下缓缓流过色谱柱，流出液用人工分段搜集后再进行分析，所以柱效较低，费时较长，最近已逐步被各种加压液相色谱所代替。加压液相色谱用载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面积均大球形硅胶微粒，如Zipax类薄壳型或表面多孔型硅球以及Zorbax类全多孔硅胶微球，其上并键合不一样极性有机化合物以适应不一样类型分离工作需要，因而柱效大大提升。常见Zorbax系列HPLC填充柱型号见表1．1。39第39页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离表1-1HPLC用Zorbax系列填充柱

40第40页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离为了提升分离速度、缩短分离时间，则须施加压力，且依所用压力大小不一样，能够分为快速色谱(flashchromatography，约2.02×105Pa)、低压液相色谱(LPLC，<5.05×105Pa)、中压液相色谱(MPLC，5.05～20.2×105Pa)及高压液相色谱(HPLC，>20.2×l05Pa)等。各种加压液相色谱分离规模以下列图所表示41第41页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离各种加压液相柱色谱大致分离规模

42第42页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离另外，在色谱柱出口处经常配以高灵敏度检测器，以及自动描记、分部搜集装置，并用计算机进行色谱条件设定及数据处理。故不论在分离效能及分离速度方面，加压液相色谱均远远超出了经典液．液分配柱色谱方法，在天然药品分离工作中得到了越来越广泛应用。下列图为惯用高压液相装置模式图。43第43页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离高压液相色谱装置模式图A．溶剂贮槽B．高压液送泵C．预防脉冲装置D．色谱柱E．进样阀F．检出装置G．统计装置H.计算机44第44页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

最近，中低压液相柱色谱装置及E．Merck企业生产配套用Lobar柱因分离规模较大(可达克数量级)、分离效果很好(有时不亚于HPLC所得结果)、分离速度较快(填充剂颗粒较大，约40～60μm)、分离条件又可由对应TLC结果直接选取，加之价格比较廉价、操作简便，故很受用户欢迎。惯用Lobar柱型号及规格可参见下表进行选择。45第45页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离惯用Lobar柱型号及可能分离规模

46第46页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离Lobar柱可选取耐压送液泵(最大不超出6.06×105Pa)或与HPLC送液泵联用。无条件时也可采取高位溶剂贮液槽造成位能差进行。在分离大量试样时，并可将几根柱子串联使用，以提升分离效果，而且用过柱子可重复再生屡次重复使用，值得推广普及。47第47页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

7．液滴逆流色谱(DCCC)及高速逆流色谱(HSC-CC)1970年，由Tanimura在液-液分配色谱基础上创建液滴逆流色谱装置(Dropletcountercurrentchromatography，简称DCCC)可使流动相呈液滴形式垂直上升或下降，经过固定相液柱，实现物质逆流色谱分离(左图)。48第48页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

液滴逆流色谱DCCC装置示意图HSCCC分离物质原理模拟图49第49页*溶剂分配法中溶剂系统选择：两相溶剂不相混溶，混合物中各单一成份在溶剂系统中分配系数差异越大越好。分离酸碱两性化合物时，缓冲液是很好溶剂。*操作注意：（1）先将两相溶剂相互充分饱和。（2）采取等体积两相溶剂方式。（3）欲分离混合物浓度不宜过高。（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离50第50页（二)依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离DCCC以及HSCCC均可克服上述液相色谱中因为采取固体载体所引发不可逆吸附消耗、试样变性污染及色谱峰畸形拖尾等弊病，试样还能够定量回收，当前已广泛用于皂苷、生物碱、酸性化合物、蛋白质、糖类等天然化合物分离精制工作，并取得了良好效果。51第51页(三)依据物质吸附性差异进行分离

在中药有效成份分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以固．液吸附用得最多，并有物理吸附、化学吸附及半化学吸附之分。

52第52页(三)依据物质吸附性差异进行分离

物理吸附(physicaladsorption)也叫表面吸附，是因组成溶液分子(含溶质及溶剂)与吸附剂表面分子分子间力相互作用所引发。特点是无选择性、吸附与解吸过程可逆、可快速进行，故在实际工作中用得最广。如采取硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂进行吸附色谱即属于这一类型；53第53页(三)依据物质吸附性差异进行分离

化学吸附(chemicaladsorption)，如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附，或生物碱被酸性硅胶吸附等，因为含有选择性、吸附十分牢靠、有时甚至不可逆，故用得较少；

半化学吸附(semi-chemicaladsorption)，如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间氢键吸附，力量较弱，介于物理吸附与化学吸附之间，也有一定应用。54第54页(三)依据物质吸附性差异进行分离

1．物理吸附基本规律——相同者易于吸附固液吸附时，吸附剂、溶质、溶剂三者统称为吸附过程中三要素。以静态吸附来说，当在某中药提取液中加入吸附剂时，在吸附剂表面即发生溶质分子与溶剂分子、以及溶质分子相互间对吸附剂表面争夺。物理吸附过程普通无选择性，但吸附强弱及先后次序都大致遵照“相同者易于吸附”经验规律。55第55页(三)依据物质吸附性差异进行分离

硅胶、氧化铝因均为极性吸附剂，故有以下特点：(1)对极性物质含有较强亲和能力，极性强溶质将被优先吸附。(2)溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出较强吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质吸附能力即随之减弱。(3)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加人极性较强溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。56第56页(三)依据物质吸附性差异进行分离活性炭因为是非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质含有较强亲和能力，在水中对溶质表现出强吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂洗脱能力将随溶剂极性降低而增强。57第57页(三)依据物质吸附性差异进行分离

2．极性及其强弱判断

极性强弱是支配物理吸附过程主要原因。极性是一个抽象概念，用以表示分子中电荷不对称(assymmetry)程度，并大致上与偶极矩(dipo1emoment)、极化度(polarizability)及介电常数(dielectrieconstant)等概念相对应。58第58页(三)依据物质吸附性差异进行分离(1)官能团极性强弱按下表次序排列：官能团极性

59第59页(三)依据物质吸附性差异进行分离(2)化合物极性则由分子中所含官能团种类、数目及排列方式等综合原因所决定。以氨基酸来说，分子结构中现有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸，如硬脂酸，虽也含有如羧基这么强极性基团，但因分子主体乃由长链烃基所组成，故极性依然很弱。又如葡萄糖，因分子中含有许多一OH基，故为极性化合物，但鼠李糖(6-去氧糖)及加拿大麻糖(2,6-二去氧糖)因分子中-CH2OH及-CHOH分别脱去氧变为-CH3及-CH2-，故极性即随之降低。60第60页(三)依据物质吸附性差异进行分离次苷D(COOH)>C(CH2OH)>A(CHO)>B(CH3)苷A>苷B>次苷D>次苷C>次苷A>次苷B>单乙酰次苷B61第61页(三)依据物质吸附性差异进行分离

极性强弱次序决定着化合物在硅胶上吸附行为及柱色谱洗脱规律

酸性、碱性及两性有机化合物极性强弱及吸附行为主要由其存在状态(游离型或离解型)所决定，并受溶剂pH影响。以生物碱而言，游离型为非极性化合物，易为活性炭所吸附；但离解型则不然，为极性化合物，不易为活性炭所吸附。所以实践中常可经过改变溶剂pH以改变酸性、碱性及两性化合物存在状态，进而影响其吸附或色谱行为到达分离精制目标。62第62页(三)依据物质吸附性差异进行分离(3)大致上溶剂极性大小能够依据介电常数(ε)大小来判断。

惯用溶剂介电常数及其极性排列如表1-5所表示：63第63页(三)依据物质吸附性差异进行分离64第64页(三)依据物质吸附性差异进行分离3．简单吸附法进行物质浓缩与精制简单吸附，如在结晶及重结晶过程中加入活性炭进行脱色、脱臭等操作，在物质精制过程中应用很广。但要注意，有时拟除去色素不一定是亲脂性，故活性炭脱色不一定总能收到良好效果。普通须依据预试结果先判断色素类型，再决定选取什么吸附剂处理为宜。另外，从大量稀水溶液中浓缩微量物质时，有时也采取简单吸附方法。比如，报道有些人曾采取活性炭吸附法成功地从一叶蔌水浸液中提取一叶蔌碱。方法为将水浸液pH调至碱性(pH8.5)，分次加入活性炭，搅拌，静置，直到上清液检验无生物碱反应时为止。滤集吸碱炭末，干燥后与苯回流，回收苯液即得一叶蔌碱。65第65页(三)依据物质吸附性差异进行分离4．吸附柱色谱法用于物质分离吸附色谱法中硅胶、氧化铝柱色谱在实际工作中用得最多。相关注意事项以下：66第66页(三)依据物质吸附性差异进行分离(1)硅胶、氧化铝吸附柱色谱过程中，吸附剂用量普通为试样量30～60倍。试样极性较小、难以分离者，吸附剂用量可适当提升至试样量1OO～200倍。据此可选取适当规格色谱管，试验室中惯用色谱管规格以下所表示，其高度与直径比(h/d)约为(15：1)～(20：1)。谱管内径(cm)：O.51.01.52.03.04.O6.08.O10长度(cm)：10153045607590120150吸附柱色谱用硅胶及氧化铝当前都有市售品，能够过筛选取。通常以100目左右为宜，如采取加压柱色谱，还能够采取更细颗粒，甚至直接采取薄层色谱用规格，其分离效果能够大大提升.67第67页(三)依据物质吸附性差异进行分离(2)硅胶、氧化铝吸附柱色谱，应尽可能选取极性小溶剂装柱和溶解试样，以利试样在吸附剂柱上形成狭窄原始谱带。如试样在所选装柱溶剂中不易溶解，则可将试样用少许极性稍大溶剂溶解后，再用少许吸附剂拌匀，并在60℃下加热挥尽溶剂，置P205真空干燥器中减压干燥，研粉后再小心铺在吸附剂柱上。68第68页(三)依据物质吸附性差异进行分离(3)洗脱用溶剂极性宜逐步增加，但跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂，并经过巧妙调整百分比以改变极性，到达梯度洗脱分离物质目标。普通，混合溶剂中强极性溶剂影响比较突出，故不可随意将极性差异很大两种溶剂组合在一起使用。试验室中最常应用混合溶剂组合如表1.6所表示。69第69页(三)依据物质吸附性差异进行分离(4)为防止发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质则宜用氧化铝进行分离。当然，硅胶、氧化铝用适当方法处理成中性时，情况会有所缓解。通常在分离酸性(或碱性)物质时，洗脱溶剂中分别加入适量醋酸(或氨、吡啶、二乙胺)，常可收到预防拖尾、促进分离效果。70第70页(三)依据物质吸附性差异进行分离(5)如液一液分配色谱中所述，吸附柱色谱也可用加压方式进行，溶剂系统可经过TLC进行筛选。但因TLC用吸附剂表面积普通为柱色谱用二倍左右，故普通TLC展开时使组分比值到达O.2～O.3溶剂系统可选取为柱色谱分离该对应组分最正确溶剂系统。71第71页(三)依据物质吸附性差异进行分离5．聚酰胺吸附色谱法聚酰胺(poliamide)吸从属于氢键吸附，是一个用途十分广泛分离方法，极性物质与非极性物质均可适用，但尤其适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物72第72页(三)依据物质吸附性差异进行分离(1)聚酰胺性质及吸附原理：商品聚酰胺均为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等惯用有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺吸附物质原理可用图1.19表示。73第73页(三)依据物质吸附性差异进行分离聚酰胺吸附色谱原理

74第74页(三)依据物质吸附性差异进行分离①形成氢键基团数目越多，则吸附能力越强。75第75页(三)依据物质吸附性差异进行分离②成键位置对吸附力也有影响。易形成份子内氢键者，其在聚酰胺上吸附即对应减弱。76第76页(三)依据物质吸附性差异进行分离③分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。77第77页(三)依据物质吸附性差异进行分离以上是仅就化合物本身对聚酰亲和力而言。但吸附因为是在溶液中进行，故障剂也会参加吸附剂表面争夺，或经过改变聚酰胺对溶质氢键结合能力而影响吸附过程。显然，聚酰与酚类或醌类等化合物形成氢键缔合能力在水中最强，在含醇中则伴随醇浓度增高而对应减弱，在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。故在聚酰胺柱色谱分离时，通惯用水装柱，试样也尽可能做成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质充分吸附，随即用不一样浓度含水醇洗脱，并不停提升醇浓度，逐步增强从柱上洗脱物质能力。甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中都有酰胺基，能够同时与聚酰胺及酚类等化合物形成氢键缔合，故有很强洗脱能力。另外，水溶液中加入碱或酸均可破坏聚酰胺与溶质之间氢键缔合，也有很强洗脱能力，可用于聚酰胺精制及再生处理。惯用聚酰胺再生剂有1O％醋酸、3％氨水及5％氢氧化钠水溶液等。78第78页(三)依据物质吸附性差异进行分离

综上分析，各种溶剂在聚酰胺柱上洗脱能力由弱至强，可大致排列成以下次序：水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液79第79页(三)依据物质吸附性差异进行分离(2)聚酰胺色谱应用：如上所述，聚酰胺对普通酚类、黄酮类化合物吸附是可逆(鞣质例外)，分离效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色谱尤其适合于该类化合物制备分离。另外，对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物分离也有着广泛用途。另外因为对鞣质吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗提取物脱鞣处理尤其适宜。聚酰胺色谱也有薄层色谱与柱色谱两种方式。80第80页(三)依据物质吸附性差异进行分离6．大孔吸附树脂大孔吸附树脂普通为白色球形颗粒，通常分为非极性和极性两类。因其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒中，所以在天然化合物分离与富集工作中被广泛应用。对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物影响。81第81页(三)依据物质吸附性差异进行分离(1)大孔吸附树脂吸附原理：大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合分离材料，它吸附性是因为范德华引力或产生氢键结果。分子筛性是因为其本身多孔性结构性质所决定。82第82页(三)依据物质吸附性差异进行分离特征：①理化性质稳定，不容于酸、碱及有机溶剂。②对有机物选择性很好。③吸附速度快。④再生处理方便。83第83页(三)依据物质吸附性差异进行分离吸附原理：①吸附性：大孔吸附树脂本身含有吸附性，是由范德华力或氢键吸附结果。②筛性原理：是由大孔吸附树脂本身多孔性所决定。84第84页(三)依据物质吸附性差异进行分离(2)影响吸附原因：比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键等是影响吸附主要原因。普通非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性树脂则易在水中吸附极性物质。糖是极性水溶性化合物，与D型非极性树脂吸附作用很弱。据此经惯用大孔吸附树脂将中药化学成份和糖分离。溶剂性质是另一个影响原因。物质在溶剂中溶解度大，树脂对此物质吸附力就小，反之就大。比如用非极性大孔吸附树脂对生物碱O．5％盐酸溶液进行吸附，其吸附作用很弱，极易被水洗脱下来，生物碱回收率很高。化合物性质也是影响吸附主要原因。化合物分子量、极性、能否形成氢键等都影响其与大孔吸附树脂吸附作用。分子量小、极性小化合物与非极性大孔吸附树脂吸附作用强。另外，能与大孔吸附树脂形成氢键化合物易被吸附。85第85页(三)依据物质吸附性差异进行分离影响大孔吸附树脂分离效果原因：①化合物分子极性大小：普通来说，大孔树脂色谱行为含有反相性质。被分离物质极性大先流出众谱柱。②分子体积大小：在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强。86第86页(三)依据物质吸附性差异进行分离(3)大孔吸附树脂应用：大孔吸附树脂现在已被广泛应用于天然化合物分离和富集工作中，如苷与糖类分离、生物碱精制。在多糖、黄酮、三萜类化合物分离方面都有很好应用实例。市售大孔树脂普通含有未聚合单体、致孔剂(多为长碳链脂肪醇类)、分散剂和防腐剂等，使用前必须经过处理。大孔吸附树脂预处理：以乙醇湿法装柱，继续用乙醇在柱上流动清洗，不时检验流出乙醇，当流出乙醇液与水混合不展现白色乳浊现象即可，然后以大量蒸馏水洗去乙醇。87第87页(三)依据物质吸附性差异进行分离(4)洗脱液选择：洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。依据吸附作用强弱选取不一样洗脱液或不一样浓度同一溶剂。对非极性大孔树脂，洗脱液极性越小，洗脱能力越强。对于中等极性大孔树脂和极性较大化合物来说，则选取极性较大溶剂为宜。普通上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不一样浓度含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。88第88页(三)依据物质吸附性差异进行分离(5)应用实例：甜叶菊苷提取分离89第89页(四)依据物质分子大小差异进行分离

天然有机化合物分子大小各异，分子量从几十到几百万，故也可据此进行分离。惯用有透析法、凝胶滤过法、超滤法、超速离心法等。前二者系利用半透膜膜孔或凝胶三维网状结构分子筛滤过作用；超滤法则利用因分子大小不一样引发扩散速度差异；至于超速离心法则系利用溶质在超速离心作用下含有不一样沉降性或浮游性。以上这些方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类脱盐精制及分离工作，对分离小分子化合物来说不太适用。可是凝胶滤过法不然，它可用于分离分子量1000以下化合物。90第90页(四)依据物质分子大小差异进行分离1．凝胶滤过法分离物质原理凝胶滤过法(Gelfiltration)也叫凝胶渗透色谱(Gelpermeationchromatography)、分子筛滤过(molecularsievefiltration)、排阻色谱(exclusionchroma—tography)，系利用分子筛分离物质一个方法。其中所用载体，如葡聚糖凝胶，是在水中不溶、但可膨胀球形颗粒，含有三维空间网状结构。91第91页(四)依据物质分子大小差异进行分离

1．凝胶滤过法分离物质原理

当在水中充分膨胀后装入色谱柱中，加入试样混合物，用同一溶剂洗脱时，因为凝胶网孔半径限制，大分子将不能渗透凝胶颗粒内部(即被排阻在凝胶粒子外部)，故在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先行流出；小分子因可自由渗透并扩散到凝胶颗粒内部，故经过色谱柱时阻力增大、流速变缓，将较晚流出。试样混合物中各个成份因分子大小各异，渗透至凝胶颗粒内部程度也不尽相同，故在经历一段时间流动并到达动态平衡后，即按分子由大到小次序先后流出并得到分离(图）92第92页(四)依据物质分子大小差异进行分离1．凝胶滤过法分离物质原理凝胶色谱简单原理图1．待分离混合物在色谱床表面2．试样进入色谱床，小分子进入凝胶颗粒内部，大分子随溶液流动3．大分子物质行程短，流出众谱床，小分子物质仍在迟缓移动93第93页(四)依据物质分子大小差异进行分离以上情况可用下式作深入说明。假定从柱上加入试样算起，至某个组分集中流出时所需溶剂体积为Ve(称为洗脱体积)，则Ve与组分分子量之间有以下关系。Ve=Kl-K2lgM因K1、K2均为常数，故洗脱体积(Ve)取决于分子量(M)大小。M越大，则Ve越小；M越小，则Ve越大。由此深入说明了凝胶滤过洗脱规律。普通，分离条件一定时，Ve重现性很好，可用来表示物质洗脱性质。94第94页(四)依据物质分子大小差异进行分离2．凝胶种类与性质商品凝胶种类很多，惯用有葡聚糖凝胶(sephadexG)以及羟丙基葡聚糖凝胶(sephadexLH-20)。95第95页(四)依据物质分子大小差异进行分离(1)葡聚糖凝胶：系由平均分子量一定葡聚糖及交联剂(如环氧氯丙烷)交联聚合而成。其部分结构以下列图所表示。生成凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂数量及反应条件。加入交联剂数量越多即交联度越高，网孔越紧密，孔径越小，吸水膨胀也越小；交联度越低，则网孔越稀疏，吸水后膨胀也越大。商品型号即按交联度大小分类，并以吸水量多少表示。以sephadexG-25为例，G为凝胶(Gel)，后附数字=吸水量×1O，故G-25示该葡聚糖凝胶吸水量为2.5ml/g。96第96页(四)依据物质分子大小差异进行分离交联葡聚糖化学结构

SephadexG型只适于在水中应用，且不一样规格适合分离不一样分子量物质97第97页(四)依据物质分子大小差异进行分离交联葡聚糖凝胶性质

98第98页(四)依据物质分子大小差异进行分离(2)羟丙基葡聚糖凝胶(sephadexLH-20)：为sephadexG-25经羟丙基化处理后得到产物。此时，葡聚糖凝胶分子中葡萄糖部分将与羟丙基结合成以下醚键形式：99第99页(四)依据物质分子大小差异进行分离与sephadexG比较，sephadexLH-20分子中-OH基总数虽无改变，但碳原子所占百分比却相对增加了。所以与sephadexG不一样，不但可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成混合溶剂中膨润使用。下表为sephadexLH-20在不一样溶剂中湿润膨胀后得到柱床体积及保留溶剂数量。100第100页(四)依据物质分子大小差异进行分离sephadexLH-20对各种溶剂保留量101第101页(四)依据物质分子大小差异进行分离sephadexLH-20除保留有sephadexG-25原有分子筛特征，可按分子量大小分离物质外，在由极性与非极性溶剂组成混合溶剂中经常起到反相分配色谱效果，适合用于不一样类型有机物分离，在天然药品分离中得到了越来越广泛应用。其中，d1-去甲乌药碱(d1-demethylco-claurine)分离实例能够代表sephadexLH-20用于物质分离普通操作过程。SephadexLH-20价格比较昂贵。用过sephadexLH-20能够重复再生使用，而且柱子洗脱过程往往就是柱子再生过程。暂时不用时能够水洗。含水醇洗(醇浓度逐步递增)_醇洗，最终泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长久不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少许乙醚洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60～80℃干燥后保留。102第102页(四)依据物质分子大小差异进行分离另外，商品凝胶还有丙烯酰胺凝胶(Bio-GelP)、琼脂糖凝胶(sepharoseBio-GelA)以及结合了不一样离子交换基团葡聚糖凝胶衍生物，如羧甲基交联葡聚糖凝胶(CM-sephadex)。二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶(DEAE—sephadex)、磺丙基交联葡聚糖凝胶(SP-sephadex)及苯胺乙基交联葡聚糖凝胶(QAE—sephadex)等，分别含有不一样特色及应用范围，相关专著中都有记载，能够参阅利用。103第103页(五)依据物质离解程度不一样进行分离天然有机化合物中，含有酸性、碱性及两性基团分子，在水中多呈离解状态，据此可用离子交换法或电泳技术进行分离。以下仅简单介绍离子交换法。104第104页(五)依据物质离解程度不一样进行分离1．离子交换法分离物质原理：离子交换法系以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当流动相流过交换柱时，溶液中中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换化合物将经过柱子从柱底流出，而含有可交换离子则与树脂上交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随即改变条件，并用适当溶剂从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。105第105页(五)依据物质离解程度不一样进行分离2．离子交换树脂结构及性质离子交换树脂外观均为球形颗粒，不溶于水，但可在水中膨胀。其基本结构以强酸性阳离子交换树脂为例，如图示：106第106页(五)依据物质离解程度不一样进行分离(1)母核部分，为由苯乙烯经过二乙烯苯(DVB)交联而成大分子网状结构，网孔大小用交联度(即加入交联剂百分比)表示。交联度越大，则网孔越小，质地越紧密，在水中越不易膨胀；交联度越小，则网孔越大，质地疏松，在水中易于膨胀，常见交联度等级如表1-9所表示。不一样交联度适于分离不一样大小分子。107第107页(五)依据物质离解程度不一样进行分离108第108页(五)依据物质离解程度不一样进行分离(2)离子交换基团：上列结构式中为磺酸基(一S03H)。另外，并可能有一N+(CH3)3Cl-，-C00H及-NH2、NH、-N等基团，依据交换基不一样，离子交换树脂分为：阳离子交换树脂强酸性(一SO3H+)弱酸性(一C00-H+)阴离子交换树脂强碱性(-N+(CH3)3Cl-)弱碱性(一NH2，NH，—N)109第109页(五)依据物质离解程度不一样进行分离离子交换树脂交换能力取决于离子交换基团数量。以强酸性阳离子交换树脂1×7(上海树脂厂#732型)为例，它对分子量89．09丙氨酸来说，1g上述阳离子交换树脂理论上能交换89.09×4.5mg丙氨酸。110第110页(五)依据物质离解程度不一样进行分离3．离子交换法应用(1)用于不一样电荷离子分离：天然药品水提取物中酸性、碱性及两性化合物可按以下图式进行有效分离，这在分离、追踪有效部位时很有用处。111第111页(五)依据物质离解程度不一样进行分离

离子交换树脂法分离物质模型

112第112页(五)依据物质离解程度不一样进行分离即使均为生物碱，但碱性强弱不一样(Ⅲ>Ⅱ>I)，仍可用离子交换树脂分离。比如将三者混合物水溶液经过NHf型弱酸性树脂，随即先用水洗下(I)，继续用NH4Cl洗下(Ⅱ)，最终用Na2C03洗下(Ⅲ)。(2)用于相同电荷离子分离：以以下三种化合物为例，113第113页(五)依据物质离解程度不一样进行分离不过，对于电荷相同且离解程度非常近似混合物来说，上述普通离子交换方法则难以取得良好分离效果，而必须采取离子交换色谱法。离子交换色谱原理与上相同，但工作要细致得多，关键在于选好固定相(树脂)及流动相(洗脱用缓冲液)。所用树脂依据待分离物质稳定性、离解基类型及强度(pKa)进行选择，并须进行干燥、粉碎，选择其中200～400目标微粒供用。而流动相除了传统应用磷酸盐缓冲液外，最近还采取由挥发性有机酸(甲酸、醋酸)、碱(如吡啶、2-甲基吡啶、三甲基吡啶、N-乙基吗啉)做成缓冲液，以利在以后采取减压浓缩或冷冻干燥法除去。常见离子交换树脂型号、性能及基本操作可参看相关专著。114第114页（六）依据物质沸点进行分离

分馏法是利用中药中各成份沸点判别进行提取分离方法，主要适合用于液体混合物分离，如挥发油和一些液体生物碱提取分离。

115第115页（六）依据物质沸点进行分离混合物沸点相差在100℃以上，能够将溶剂重复蒸馏屡次，即可到达分离目标，假如沸点相差在25℃以下，则需要采取分馏柱，沸点相差越小，需要分流装置越精细。116第116页吸附色谱凝胶过滤色谱离子交换色谱大孔树脂色谱分配色谱色谱分离法色谱分离法小结117第117页

原理：利用被分离成份在固定项和流动项之间分配系数不一样而到达分离。

分配色谱液．液萃取法与PC、逆流分溶法(CCD)、液滴逆流色谱法(DCCC)、高速逆流色谱(HSCCC)、118第118页

分类正相色谱：固定相极性>流动相极性，用于分离极性和中等极性成份。反相色谱：固定相极性<流动相极性，用于分离非极性和中等极性成份分配色谱分配色谱119第119页3、洗脱规律：正相色谱中，极性小化合物先被洗脱（固定向极性大），极性大化合物后被洗脱；反相色谱恰好相反。4、惯用固定相和流动相固定相：正相色谱中惯用氰基或氨基键合相；反相色谱中惯用C18或C8键合相。流动相：正相色谱中主要用有机溶剂；反相色谱中惯用甲醇-水或乙腈-水系统。分配色谱分配色谱120第120页吸附色谱硅胶氧化铝：极性吸附活性炭：非极性吸附聚酰胺：氢键吸附大孔树脂色谱(酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物酚羟基，或酰胺键上游离胺基与醌类、脂肪羧酸上羰基)利用吸附剂对被分离化合物分子吸附能力差异，实现分离一类色谱121第121页*氧化铝由氢氧化铝直接在高温下脱水制得，带微碱性，适于分离碱性成份。

*聚酰胺适于分离黄酮、酚、醌类、有机酸及鞣质，可使性质极相近化合物得到分离。

原理：聚酰胺中酰胺基可与酚羟基、羧基、羰基、硝基等形成氢键吸附。聚酰胺吸附容量大。吸附色谱122第122页被分离成份结构与吸附力关系：1）可形成氢键基团数目越多，则吸附能力越强，越难被洗脱。2）形成份子内氢键物质吸附能力会减弱。3）分子中芳香化程度越高，吸附能力越强。4）对聚酰胺柱洗脱能力，与溶剂种类相关：甲酰胺，丙酮，甲、乙醇，水依次减弱。吸附色谱123第123页（2）溶剂对于极性吸附剂，溶剂极性越大，洗脱能力越强。对于非极性吸附剂，则相反。（3）被分离物质对于极性吸附剂，被分离物质极性越强，吸附力越大，越难洗脱。吸附色谱124第124页大孔吸附树脂法1、性能及分离原理（1）性能：大孔树脂是一个不含交换基团，含有大孔结构高分子吸附剂。普通为白色颗粒，20~60目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。水溶液中吸附力较强，且有很好选择性。（2）原理现有吸附性，又有分子筛筛选性。吸附性是范德华引力或氢键吸附结果；筛选性则由其多孔性网状结构引发。吸附色谱125第125页凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过、排阻色谱）原理：分子筛作用葡聚糖凝胶（sephadexG）

羟丙基葡聚糖凝胶(sephadexLH-20)126第126页1、基本原理基于混合物中各成份解离度不一样而分离。2、离子交换剂种类离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶。

3、应用主要用于生物碱、有机酸及氨基酸、蛋白质、多糖等水溶性成份分离纯化。4、操作关键点装柱前要用水充分溶胀，并用酸、碱预处理。离子交换色谱127第127页分离法（小结）（一）依据物质溶解度差异进行分离（二）依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离（三）依据物质吸附性差异进行分离（四）依据物质分子大小差异进行分离（五）依据物质解离程度不一样进行分离（六）依据物质沸点进行分离

128第128页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法中药材→提取→分离→有效成份→判定→化学结构→生物活性129第129页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法一、化合物纯度测定

如检验有没有均匀一致晶形，有没有明确、敏锐熔点。如在TLC或PC上选择适当展开剂。普通，只有当样品在三种展开系统中展现单一斑点时方可确认其为单一化合物。GC和HPLC也是判断物质纯度一个主要方法。

物理常数：熔点、沸点、比旋度、折光率等；

130第130页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法化学成份纯度判断三种以上展开系统展开，TLC上均为单一斑点。具一定晶型和均匀色泽。具固定熔点，熔距在1～2℃以内。具固定比旋度。HPLC检测为一个单峰。实际工作中我们要结合上述各种方法，综合考虑。131第131页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法二、结构研究主要程序

初步推断化合物类型——测定分子式，计算不饱和度——确定分子中含有官能团，或结构片断，或基本骨架——推断并确定分子平面结构——推断并确定分子立体结构（构型、构象）。

132第132页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法程序：1.初步推断化合物类型方法：1.注意观察试样在提取、分离过程中行为。2.测定相关理化常数，如不一样pH、不一样溶剂中溶解度及色谱行为、灼烧试验、化学定性反应等。133第133页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法程序：2.测定分子式，计算不饱和度方法：

3.结合文件调研。分子式测定方法：（1）元素定量分析配合分子量测定。（2）同位丰度比法；（3）HR-MS.计算不饱和度134第134页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法程序：3.确定分子中含有官能团，或结构片断，或基本构架方法：

（1）官能团定向及定量分析（2）测定并解析化合物相关谱学数据；如UV、IR、MS、1H-NMR及3C-NMR。

结合文件调研135第135页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法程序：4.推断并确定分子平面结构方法：（1）综合分析谱学数据及官能团定性、定量分析结果。（2）与已知化合物进行比较或化学沟通（化学降解、衍生物制备或人工合成）。136第136页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法

三、结构研究中采取主要方法

（一）确定分子式并计算不饱和度

分子式测定可用元素定量分析配合分子量测定、同位素峰度比法和高分辩质谱（HR－MS）法

137第137页2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法（二）质谱（MS）测定有机分子分子量。正确判断离子峰，提供分子量。分析碎片离子，推断结构信息。惯用有：电子轰击质谱（提供分子离子峰和碎片离子峰）；场解析质谱（可得到显著分子离子峰）等。138第138页（三）红外光谱（IR)特征官能团化合物用量只需5~10微克，测定范围500~4000cm-1,有两个区，一个是指纹区在1000cm-1以下，每个化合物有自己特征指纹图谱；另一个是特殊功效区，在1000~4000cm-1，能够确定羰基、苯环、羟基等功效基。2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法139第139页（四）紫外光谱（UV）共轭体系只有在分子结构中含有共轭体系，即在分子中含有产生π-π、n-π跃迁和一些n-σ跃迁化合物才能在紫外光区产生紫外吸收光谱。可依据紫外吸收光谱位置及吸收峰数目，可初步推测化合物不饱和部分结构。2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法140第140页3、核磁共振谱(NMR)(1)1H-NMR（氢核磁共振）

:提供不一样种类氢原子情况。给出氢数目、种类、相邻基团结构。可提供结构信息参数，主要为化学位移(δ),偶合常数(J)及质子数。化学位移(δ)：因氢核周围化学环境不一样，其外围电子云密度及绕核旋转产生磁屏蔽效应不一样，则不一样氢出现在不一样区域。2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法141第141页偶和常数(J)：磁不等同两个或两组氢核，在一定距离内因相互自旋偶合产生裂分，裂分峰间距离为J。（2）13C-NMR:提供碳原子情况。可提供结构信息参数，主要为化学位移、异核偶合常数(JCH)及弛豫时间。测定技术也有各种去偶方法，最惯用是质子宽带去偶，13C信号在图谱上为单峰。2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法142第142页

13CNMR在结构研究中，可提供结构研究信息是：

A.确切分子式

B.分子量

C.C周围化学环境

D.推测一些官能团存在

E.全部分子结构

答案：CD

1HNMR能提供化学信息是：

A.质子化学位移

B.C核化学位移

C.质子积分面积

D.质子间偶合常数

E.质子与C偶合常数

答案：ACD2.3中药化学成份结构测定普通程序和方法143第143页

提取分离方法一、天然药品有效成份提取（一）惯用溶剂特点：环己烷，石油醚，苯，乙醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇

极性：小————大

亲脂性：大————小亲水性：小————大第二章总结144第144页比水重有机溶剂：氯仿与水分层有机溶剂：环己烷~正丁醇能与水分层极性最大有机溶剂：正丁醇与水能够以任意百分比混溶有机溶剂：丙酮~甲醇极性最大有机溶剂：甲醇极性最小有机溶剂：环己烷介电常数最小有机溶剂：石油醚惯用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成份有机溶剂：正丁醇溶解范围最广有机溶剂：乙醇第二章总结145第145页（二）各种提取方法：常见提取方法有：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法。其中，溶剂提取法应用最广。第二章总结146第146页溶剂提取法（1）溶剂提取法原理：依据相同者相溶原理，选择与化合物极性相当溶剂将化合物从植物组织中溶解出来，同时，因为一些化合物增溶或助溶作用，其极性与溶剂极性相差较大化合物也可溶解出来。（2）各种溶剂提取法溶剂提取法普通包含浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等，其使用范围及特点见下表。第二章总结147第147页提取方法溶剂操作提取效率使用范围备注浸渍法水或有机溶剂不加热效率低各类成份，尤遇热不稳定成份出膏率低，易发霉，需加防腐剂渗漉法有机溶剂不加热—脂溶性成份消耗溶剂量大，费时长煎煮法水直火加热—水溶性成份易挥发、热不稳定不宜用回流提取法有机溶剂水浴加热—脂溶性成份热不稳定不宜用，溶剂量大连续回流提取法有机溶剂水浴加热节约溶剂、效率最高亲脂性较强成份用索氏提取器，时间长第二章总结148第148页（2）水蒸气蒸馏法：适合用于含有挥发性、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏、难溶或不溶于水成份提取，如挥发油、小分子香豆素类、小分子醌类成份。（3）升华法：固体物质受热不经过熔融，直接变成蒸汽，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。中草药中有一些成份含有升华性质，能够利用升华法直接自中草药中提取出来。如樟脑、咖啡因。第二章总结149第149页分离与精制：（一）依据物质溶解度差异进行分离结晶及重结晶法利用不一样温度可引发物质溶解度改变性质以分离物质。将不是结晶状态固体物质处理成结晶状态操作称结晶；将不纯结晶深入精制成较纯结晶过程称重结晶。第二章总结150第150页（1）溶剂选择普通标准：不反应；冷时对所需要成份溶解度较小，而热时溶解度较大；对杂质溶解度很大或很小；沸点低，易挥发；无毒或毒性小。若无理想单一溶剂时，能够考虑使用混合溶剂。普通惯用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。（2）结晶操作：结晶操作实际是深入分离纯化过程，普通是应用适量溶剂在加热至沸点情况下将化合物溶解，制成过饱和溶液，趁热过滤去除不溶性杂质，放置冷处，以析晶。第二章总结151第151页（3）结晶纯度判定：结晶形态和色泽：单一化合物结晶含有结晶形状均一和均匀色泽。熔点和熔距：单一化合物含有一定熔点和较小熔距，结晶前后熔点应一致，熔距很窄，在1℃

2℃范围内。但要注意双熔点，如汉防己乙素、芫花素及一些与糖结合苷类化合物。色谱法：单一化合物在薄层色谱或纸色谱层析中经三种不一样溶剂系统展开，均为一个斑点者。第二章总结152第152页2．溶剂分离法：（1）在中草药提取液中加入另一个溶剂以改变混合物溶剂极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。如：水—醇法除多糖、蛋白质等水溶性杂质；醇—水法除树脂、叶绿素等水不溶性杂质；醇—醚法或醇—丙酮法使苷类成份，而脂溶性树脂等杂质则存留在母液中。（2）对酸性、碱性或两性有机化合物来说，通常经过加入酸、碱以调整溶液pH，以改变分子存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。如：酸提碱沉法，碱提酸沉法等。（3）沉淀法：酸性或碱性化合物还可经过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性盐类沉淀等析出。如加入铅盐、雷氏铵盐等。第二章总结153第153页（二）依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离。1．两相溶剂萃取法（1）原理：利用混合物中各成份在两相互不相溶溶剂中分配系数不一样而实现分离。萃取时假如各成份在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。第二章总结154第154页（2）各种萃取方法：①简单萃取：利用分液漏斗进行两相溶剂萃取。②逆流连续萃取法：是一个连续两相溶剂萃取法。其装置可含有一根、数根或更多根萃取管。③逆流分配法（CCD）：又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，与两相溶剂逆流萃取法原理一致，对于分离含有非常相同性质混合物效果很好。④液滴逆流分配法（DCCC）：本法必须选取能生成液滴溶剂系统，且对高分子化合物分离效果较差，处理样品量小，并要有一定设备，操作较繁琐。普通

50时，简单萃取即可分离，

50时，则易采取逆流分溶法。第二章总结155第155页2．纸色谱（PPC）：纸色谱原理与液—液萃取法基本相同。原理：分配原理支持剂：纤维素固定相：水流动相：水饱和有机溶剂Rf值：化合物极性越小，Rf值越大；反之，化合物极性越大，Rf值越小。应用：用作微量分析，尤其适合于亲水性较强成份，其层析效果往往比吸附薄层色谱效果好。但纸层析普通需要较长时间。第二章总结156第156页（三）依据物质吸附性差异进行分离其中以固—液吸附用最多，并有物理吸附（硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行吸附色谱）、化学吸附（黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等）及半化学吸附（聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间）之分。第二章总结157第157页1．物质吸附规律：（1）物理吸附过程普通无选择性，但吸附强弱大致遵照“相同者易于吸附”经验规律。（2）被分离物质与吸附剂、洗脱剂共同组成吸附层析三要素，彼此紧密相连。第二章总结158第158页惯用极性吸附剂：硅胶、氧化铝。硅胶显微酸性，适于分离酸性和中性化合物，分离生物碱时需在流动相中加入适量有机碱；氧化铝呈碱性，适于分离生物碱等碱性成份，不宜用于分离有机酸、酚性等酸性成份。均为极性吸附剂，故有以下特点：第二章总结159第159页①被分离物质极性越强，吸附力越强。强极性溶质将优先被吸附。②溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质吸附能力越强。随溶剂极性增强，则吸附剂对溶质吸附力将减弱。③当加入极性较强溶剂后，先前被硅胶或氧化铝所吸附溶质可被置换而洗脱出来。惯用非极性吸附剂：活性炭。对非极性物质含有较强亲和力，在水中对溶质表现出强吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附物质时，溶剂极性越小，洗脱能力越强。第二章总结160第160页2．极性及其强弱判断：（1）普通化合物极性按以下官能团次序增强：—CH2—CH2—，—CH2=CH2—，—OCH3，—COOR，>C=O，—CHO，—NH2，—OH，—COOH第二章总结161第161页（2）溶剂极性可大致依据介电常数大小来判断。介电常数越大，则极性越大。普通溶剂介电常数按以下次序增大：环己烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47），氯仿（5.20），