重组体的选择与鉴定

关于重组体的选择与鉴定何为重组体？转化子：在DNA分子克隆中，通常将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子；重组体：含有重组DNA分子的转化子；目的重组体：含有外源目的基因的重组体。第2页,共29页，2024年2月25日，星期天为什么要对重组子进行选择与鉴定在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子,因为在连接反应中会有以下几种情况发生:载体和一个或数个串联目的基因连接载体发生自连目的DNA分子发生自连未发生连接反应的载体和目的DNA片段第3页,共29页，2024年2月25日，星期天为什么要对重组子进行选择与鉴定因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子的方案并加以验证。第4页,共29页，2024年2月25日，星期天常用的选择方法第5页,共29页，2024年2月25日，星期天直接选择法第6页,共29页，2024年2月25日，星期天遗传学表型筛选方法一—抗药性筛选分类：（1）抗药性基因不失活（2）抗药性基因失活常用的抗药性选择标记：氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）

卡那霉素（Kan）、四环素（Tet或Tc）

链霉素（Sm或Str）第7页,共29页，2024年2月25日，星期天抗药性基因不失活基本原理：外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外，不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能生长而被排除。第8页,共29页，2024年2月25日，星期天抗药性基因不失活实验步骤：（1）培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板；（2）将转化后的菌液均匀涂布在平板上；（3）放在37℃培养箱培养12~16小时；（4）观察菌落生长情况。第9页,共29页，2024年2月25日，星期天抗药性基因不失活第10页,共29页，2024年2月25日，星期天抗药性基因失活基本原理：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。第11页,共29页，2024年2月25日，星期天抗药性基因失活例如：非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是,如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段,就会造成氨苄青霉素抗性基因失活,携带这种质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长,而不能在氨苄青霉素抗性平板上生长。第12页,共29页，2024年2月25日，星期天抗药性基因失活第13页,共29页，2024年2月25日，星期天抗药性基因失活注意事项：（1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物时，37℃培养时间约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。（2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的菌落在培养基中震荡培养。第14页,共29页，2024年2月25日，星期天遗传学表型筛选方法二

β-半乳糖苷酶显色法基本原理：许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检测功能。

当外源DNA插入到它的lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶）上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。（X-gal是β-半乳糖苷酶的显色底物）第15页,共29页，2024年2月25日，星期天遗传学表型筛选方法二

β-半乳糖苷酶显色法

举例：pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的β-半乳糖苷酶片段都没有活性。第16页,共29页，2024年2月25日，星期天

遗传学表型筛选方法二

β-半乳糖苷酶显色法当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。第17页,共29页，2024年2月25日，星期天遗传学表型筛选方法二

β-半乳糖苷酶显色法第18页,共29页，2024年2月25日，星期天遗传学表型筛选方法二

β-半乳糖苷酶显色法注意事项：（1）由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长时间，因此，观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。与37℃温箱取出后放4℃冰箱几小时后观察效果更好；（2）为了防止假阳性需挑菌进一步验证。第19页,共29页，2024年2月25日，星期天间接选择法第20页,共29页，2024年2月25日，星期天依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一快速裂解菌落鉴定分子大小基本原理：由于外源片段插入的重组质粒与载体大小不同，故可以利用琼脂糖凝胶电泳将重组体分离出来。第21页,共29页，2024年2月25日，星期天依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一

快速裂解菌落鉴定分子大小优点：直观快捷，适用于插入片段较大的重组子的筛选。缺点：不能鉴别插入片段大小相近的非目的基因片段。第22页,共29页，2024年2月25日，星期天依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二

——限制性内切酶酶切法基本原理：根据已知的外源DNA序列的限制酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA的带数和长度）。或用合适的内切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切这个片段，电泳后比较电泳结果是否符合预计的结果。第23页,共29页，2024年2月25日，星期天依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二

——限制性内切酶酶切法第24页,共29页，2024年2月25日，星期天依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三

PCR法基本原理：在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。第25页,共29页，2024年2月25日，星期天依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三

PCR法注意事项：如需检测插入片段及其方向，则使用载体特异引物和方向插入特异引物或互换。如只需确认是否存在插入片段，可用2个插入片段特异引物。

扩增反应前在94℃变性两分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功。第26页,共29页，2024年2月25日，星期天依赖于重组子结构特征分析的筛选方法四

菌落杂交筛选主要原理

用体外标记基因DNA或相应的RNA为探针同转化后的菌落进行原位杂交，筛选含重组DNA的克隆。这个方法可以快速地从数百个菌落中挑选出含有重组DNA的克隆。该方法的优点是通用性比较强，可以用来检测任何一种插入的DNA序列。这种方法依据的是核酸分子杂交的原理，而不以插入的DNA序列能否实现基因表达为前提，因此，只要有可利用的标记探针就可检测出重组质粒DNA。第27页,共29页，2024年2月25日，星期天总结