基于转录组测序枇杷EST-SSR标记的开发与利用

基于转录组测序枇杷EST-SSR标记的开发与利用枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)起源于我国东南部,是中国特色水果,具有极高医疗保健价值,栽培历史悠久,品种繁多,与其他国家相比我国枇杷种质资源更为丰富。但目前对枇杷的遗传研究及基因组信息研究较少,因此我们需要对枇杷进行更深一步的分子基因组研究,为其种质资源分类、遗传多样性分析及分子标记辅助选育等研究奠定基础。本试验通过对洞庭枇杷的转录组进行大规模测序,利用获得的转录组序列进行EST-SSR分子标记的开发,将开发的标记进行枇杷及其近缘物种间的通用性分析和遗传多样性分析,并对洞庭野生型和突变型枇杷进行特异EST-SSR片段克隆进而对其差异基因进行探讨,主要研究结果如下：1.我们总共获得61587个Unigene,对其进行微卫星搜索,得到6693个Unigene包含7649个SSR位点。在对SSR位点进行重复类型统计发现,在二核苷酸到六核苷酸之间,重复类型最多的是二核苷酸其数量总计4593,占所有重复类型的60.05%;最少的重复类型是五核苷酸,占总数的2.08%。在对重复类型最多的序列进行统计发现,重复序列中出现频率最高的是二核苷酸重复类型中的AG/CT,占所有重复序列的52.6%；其次是三核苷酸重复类型中的AAG/CTT和AGG/CCT,分别占所有重复序列的6.6%和6%;而在二核苷酸重复序列类型中没有出现CG/GC重复序列。2.通过MISA搜索获得到7649个SSR位点,成功设计出278对引物,我们用这278对引物在‘洞庭红肉’和‘洞庭白肉,枇杷中进行扩增,结果发现其中246对引物都可以得到清晰明亮条带,扩增效率达到88.5%。3.从278对EST-SSR引物中选择扩增效果好、条带明亮和具有高多态性的25对引物分别对18份枇杷种质、6份苹果种质以及3份桃种质进行扩增,结果发现这25对引物在这三种材料中扩增效果都达到了92%,说明我们在洞庭枇杷上开发的EST-SSR分子标记在其他枇杷品种及其近缘物种上也具有一定通用性；并且我们发现Ejl、Ej46、Ej229这三对引物可以用于区分这三大类试材。4.在25对引物中其中22对都分别在三类材料上表现出了多态性,占88%。我们对22条EST-SSR引物在18份枇杷种质上扩增的条带数进行统计,计算其等位基因数、有效等位基因数、香农指数、多态信息含量、期望杂合度和观察杂合度,发现所有遗传参数的结果保持一致,其中Ej76引物的等位基因数为4.000、有效等位基因数为3.429、香农指数为1.297、多态信息量为0.654、期望杂合度为0.729,表现出最高的多态性；而Ej193、Ej229这两对引物等位基因数为2.000、有效等位基因数为1.385、香农指数为0.451、多态信息量为0.239、期望杂合度为0.286,表现出最低的多态性。通过建立0-1矩阵数据表计算出18份枇杷种质的SM遗传相似系数,根据相似系数进行聚类,当SM相似系数D1=0.666时,将18份枇杷种质分为4大类,表现出丰富的遗传多样性。5.我们将278对引物在野生型‘洞庭红肉’枇杷和突变型‘洞庭白肉’枇杷上进行多次验证,Ej85和Ej94两对引物因其在两个材料上的差异表现出稳定性好、重复性高的特点而被我们选择进行差异EST-SSR片段克隆测序。Ej85引物在两种枇杷上扩增的差异条带大小为134bp,具体序列如下：TCCGTCTTCGTCGTCTTCTTTTATTTCTCTCTCTGTTCCGCCCTCCTCCTTTACACACACACACACCTCCCACCTCTCTGAACGATTGAAAGCAAAATTAATGGAGTGGGATGGTAATTCGGATCTGGGCTTTGEj94在‘洞庭红肉’枇杷扩增的差异条带大小为259bp,具体序列如下：ATTGCTGGAGCTCGAAAGAAACGTCTTCAGAAACTGGGTTTTTCAGTGGTACAATTTGATATCGATCAGAGATTGACAAAGAAGGATGGAGCTTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGCCATTTGGCTTTAAGCTATCAAGTATCAACCGTTCTTTTTGTCAACATAACTGTGTTCGGAATTTGCTTTTCTGCAAATTTTTATGGCCTTAGGGTTTTGATGGGATTAGAGTAAAGATACGGCCGTTTGGEj94在‘洞庭白肉’枇杷扩增的差异条带大小为221bp,具体序列如下：ATTGCTGGAGCTCGAAAGAAACGTCTTCAGAAACTGGGTTTTTCAGTGGTACAATTTGATATCGATCAGAGATTGACAAAGAAGGATGGAGCTTTTGGCTTTAAGCTATCAAGTATCAA