重要生物制药制造工艺

关于重要生物制药制造工艺§2多肽与蛋白质类药物第2页,共56页，2024年2月25日，星期天§2多肽与蛋白质类药物一、多肽与蛋白质药物概述二、多肽与蛋白质药物的生产方法三、重要多肽与蛋白质类药物制备第3页,共56页，2024年2月25日，星期天研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物

第4页,共56页，2024年2月25日，星期天多肽类药物分类多肽激素垂体多肽激素促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激素（LPH）、催产素（OT）、加压素（AVP）等下丘脑激素促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH）甲状腺激素甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）胰岛激素胰高血糖素、胰解痉多肽胃肠道激素胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、肠泌素、肠血管活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、缓激肽、P物质胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子第5页,共56页，2024年2月25日，星期天第6页,共56页，2024年2月25日，星期天多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。含有多肽成分的其它生化药物

骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、助应素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。多肽类药物分类第7页,共56页，2024年2月25日，星期天第8页,共56页，2024年2月25日，星期天蛋白质激素垂体Pr激素生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。促性腺激素人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性腺激素（HMG），血清性促性腺激素（SGH）。胰岛素及其他Pr激素胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。血浆蛋白质白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白（FN）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，Veil’s病免疫球蛋白，抗－D免疫球蛋白，抗－HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ。蛋白质类药物分类第9页,共56页，2024年2月25日，星期天第10页,共56页，2024年2月25日，星期天蛋白质类细胞生长调节因子干扰素α、β、γ（IFN）,白细胞介素（IL），神经生长因子（NGF），肝细胞生长因子（HGF），血小板衍生的生长因子（PDGF），肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子(tPA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白（BMP）。粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。胶原蛋白明胶、阿胶等碱性蛋白质硫酸鱼精蛋白蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂凝集素PHA、ConA蛋白质类药物分类第11页,共56页，2024年2月25日，星期天第12页,共56页，2024年2月25日，星期天二、多肽与蛋白质类药物的生产方法①提取分离纯化法②化学合成法③利用基因工程制备过程：生物材料的选取与破碎有效成分的提取有效成分的分离纯化第13页,共56页，2024年2月25日，星期天原料选择上清破碎提取沉淀

变性复性蛋白质纯化蛋白质药物－SeparationandPurification纯度活性鉴定合格不合格精品

发酵

生物组织第14页,共56页，2024年2月25日，星期天

Protein--Separation1、原料选择2、提取第15页,共56页，2024年2月25日，星期天§2多肽与蛋白质类药物在目的物提取时应考虑的方面：①溶剂的选择②离子强度③pH④温度⑤稳定性⑥提取时间第16页,共56页，2024年2月25日，星期天§2多肽与蛋白质类药物3、分离纯化（1）蛋白质的粗分离---分辨率低盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离（2）蛋白质的精制分离柱色谱法、密度梯度离心法、电泳法、亲和层析法

第17页,共56页，2024年2月25日，星期天Protein--Purification1）pI2）分子形状和大小3）溶解度4）电离性质不同5）功能专一性6）疏水基团与相应的载体基团结合7）在溶剂系统中分配8）选择性吸附9）其他特殊性质第18页,共56页，2024年2月25日，星期天4、分离纯化方法的选择（1）分离纯化的早期使用方法的选择（2）各种分离纯化方法的使用程序（3）分离纯化后期的保护性措施（4）对每一步骤方法的优势进行综合评价

第19页,共56页，2024年2月25日，星期天纯化方法选择指南第20页,共56页，2024年2月25日，星期天5.溶液中蛋白质浓度的测定：常用紫外吸收法、双缩脲法、福林－酚试剂法、考马斯亮蓝染色法6、纯度检查（1）HPLC或FPLC（2）电泳法（3）免疫化学法（4）生物测定法（5）分光光度法①紫外分光光度法

②红外分光光度法第21页,共56页，2024年2月25日，星期天多肽化学合成概述合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。合成方法：（1）液相合成（2）固相合成（1963年R.B.Merrifield创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖）第22页,共56页，2024年2月25日，星期天多肽合成的主要步骤

氨基的保护和羧基的活化羧基的保护和氨基的活化接肽和去保护基1、基团保护氨基保护基

苄氧羰基——强酸脱除叔丁氧羰基（BOC）——三氟乙酸（TFA）脱除

9-芴甲氧羰基（Fmoc）--哌啶-CH2Cl2或哌啶-DMF脱除

第23页,共56页，2024年2月25日，星期天2.液相合成肽法阶梯伸长法----合成小肽

混合酸酐法----常用DCC法

(R1CO)2O

活化酯法H-Gly-OMEZ-Leu-Gly-OME片断缩合法----合成大肽

叠氮法R2-NH2Z-Leu-OC6H4NO2R1-CO-NH-R2第24页,共56页，2024年2月25日，星期天片断缩合法----合成大肽叠氮法第25页,共56页，2024年2月25日，星期天多肽的固相合成(Fmoc保护法)

（1978年改进的方法，避免了强酸处理）第26页,共56页，2024年2月25日，星期天（三）基因工程法优点：1.可生产过去难以获得的蛋白和多肽2.可深入研究活性物质的生理、生化和结构，扩大应用范围；3.可发现、挖掘更多内源性生理活性物质4.可改造和去除内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处；5.可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第27页,共56页，2024年2月25日，星期天三、重要的多肽与蛋白质类药物的制备（一）主要多肽类药物的制备1.胸腺激素（Thymushormones）（1）胸腺素（Thymocln）①结构和性质---胸腺素组分5第28页,共56页，2024年2月25日，星期天②生产工艺：工艺路线第29页,共56页，2024年2月25日，星期天（2）胸腺肽（Thymuspeptides）①结构和性质：②生产工艺：第30页,共56页，2024年2月25日，星期天1922年--从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。

1926年--重结晶胰岛素

1930s--传统中、长效动物胰岛素

70s末--半合成胰岛素1982年--采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90s至今--重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物

胰岛素（insulin）第31页,共56页，2024年2月25日，星期天FrederickBantingCharlesBest第32页,共56页，2024年2月25日，星期天猪胰岛素牛胰岛素赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins）门冬胰岛素（诺和诺德公司、速效Ins）甘精胰岛素(安万特公司、长效Ins)人胰岛素（Insulin）B30A8;A10;B30B28;B29B28A21;B31;B32第33页,共56页，2024年2月25日，星期天3DStructureofInsulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer）第34页,共56页，2024年2月25日，星期天Ins的性质

第35页,共56页，2024年2月25日，星期天目前临床使用的胰岛素来源

动物胰脏来源----经动物胰脏提取或适当提纯的猪、牛胰岛素

半合成胰岛素----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产胰岛素----重组DNA技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素第36页,共56页，2024年2月25日，星期天动物来源的胰岛素（28种）药品名称生产企业药品名称生产企业ILETINILILLYNPHPURIFIEDPORKISOPHANEINSULINNOVONORDISKINCILETINIILILLYPROTAMINEZINC&ILETINI(BEEF-PORK)LILLYINSULINNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINIILILLYINSULININSULATARDNPHNORDISKNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINII(PORK)LILLYINSULINNORDISKMIXTARD(PORK)NOVONORDISKINCPROTAMINEZINCINSULINBRISTOLMYERSSQUIBBLENTARDNOVONORDISKINCREGULARILETINIILILLYLENTENOVONORDISKINCREGULARILETINII(PORK)LILLYLENTEILETINIILILLYREGULARPURIFIEDPORKINSULINNOVONORDISKINCLENTEILETINII(PORK)LILLYREGULARINSULINNOVONORDISKINCLENTEINSULINNOVONORDISKINCSEMILENTENOVONORDISKINCNPHILETINI(BEEF-PORK)LILLYSEMILENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHILETINIILILLYULTRALENTENOVONORDISKINCNPHILETINII(PORK)LILLYULTRALENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHINSULINNOVONORDISKINCVELOSULINNOVONORDISKINC第37页,共56页，2024年2月25日，星期天半合成来源的胰岛素（5种）药品名称生产企业INSULATARDNPHHUMANNOVONORDISKINCMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSNOVOLIN70/30NOVONORDISKINCNOVOLINLNOVONORDISKINCNOVOLINNNOVONORDISKINC第38页,共56页，2024年2月25日，星期天基因重组来源的胰岛素（27种）药品名称生产企业药品名称生产企业APIDRASANOFIAVENTISUSLANTUSSANOFIAVENTISUSEXUBERAPFIZERLEVEMIRNovoNordiskHUMALOGLILLYMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSHUMALOGMIX50/50LILLYNOVOLIN70/30NovoNordiskHUMALOGMIX75/25LILLYNOVOLINLNOVONORDISKINCHUMALOGPENLILLYNOVOLINNNOVONORDISKINCHUMULIN50/50LILLYNOVOLINRNOVONORDISKINCHUMULIN70/30LILLYNOVOLINR（Purified）NOVONORDISKINCHUMULIN70/30PENLILLYNOVOLOGNOVONORDISKINCHUMULINBRLILLYNOVOLOGMIX70/30NOVONORDISKINCHUMULINLLILLYVELOSULINBRNOVONORDISKINCHUMULINNLILLYVELOSULINBRHUMANNOVONORDISKINCHUMULINRLILLYHUMULINULILLYHUMULINRPENLILLY第39页,共56页，2024年2月25日，星期天通化东宝

1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖”

甘舒霖®R--常规重组人胰岛素注射液甘舒霖®N--低精蛋白重组人胰岛素注射液甘舒霖®30R--30/70混合重组人胰岛素注射液（30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素）深圳科兴

苏泌啉--常规重组人胰岛素注射液苏泌啉恩--低精蛋白重组人胰岛素注射液

徐州万邦

万邦林--常规重组人胰岛素注射液万苏林—猪胰岛素制剂胰岛素国内主要生产厂家其他（持有药品注册证）

---南京新天、上海第一生化、武汉生化等第40页,共56页，2024年2月25日，星期天临床用胰岛素分类普通胰岛素：从动物胰脏中提取人胰岛素传统中长效胰岛素速效胰岛素速效人胰岛素类似物长效人胰岛素类似物非注射胰岛素第41页,共56页，2024年2月25日，星期天

传统中长效胰岛素制剂

低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌结晶例：Eli，HumulinNNovo，NovolinN

胰岛素锌混悬液缺陷：作用时间少于24小时作用峰值明显，夜间低血糖危险性高吸收不稳定结霜现象，沉淀玻璃瓶壁，丧失活性第42页,共56页，2024年2月25日，星期天速效胰岛素礼来公司，Humulin30/70(30%常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素)Humulin50/50诺和诺德，Novolin30/70Novolin50/50第43页,共56页，2024年2月25日，星期天速效胰岛素起效时间达峰时间峰持续时间作用消除时间常规皮下Ins:30-90min1.5-2.5h2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h特点：起效快，皮下注射后15min起效达峰快，30～60min达药效高峰药效维持t短，约3h左右（2～4h）第44页,共56页，2024年2月25日，星期天

B26-30对于Ins结合Ins受体的功能无关，但对Ins形成二聚体的结构特点有关。因此对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降，且与Ins受体结合能力不变的新型速效Ins类似物。研制机理已上市药物：Lispro、Aspart、Apidra速效胰岛素类似物第45页,共56页，2024年2月25日，星期天Lispro（赖脯Ins）Aspart（门冬Ins

）APIDRA（赖谷Ins

）第46页,共56页，2024年2月25日，星期天InsulinDetemir（Levemir®）诺和诺德公司研制

glargine（Lantus®）安万特公司研制长效胰岛素类似物第47页,共56页，