P62调节Nrf2信号通路在弓形虫感染中的作用机制研究

P62调节Nrf2信号通路在弓形虫感染中的作用机制研究弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种机会性致病原虫病,对我国畜牧养殖业危害巨大,可造成家畜高热、神经症状、呼吸困难、孕畜流产、畸形胎甚至死胎现象的发生。弓形虫几乎可以感染全部温血动物的有核细胞,作为在食物链最顶端的人类,通过食入生肉或未煮熟的肉食后,从而感染弓形虫。弓形虫病作为一种重要的人兽共患寄生虫病,在全球范围内高度流行,世界上有三分之一的人类受到该病的影响,对公共卫生安全危害巨大。在人类中弓形虫病主要的发病症状为孕妇流产、产畸胎、弱胎甚至死胎,以及儿童生长发育缓慢甚至死亡等。而在家畜中,弓形虫多感染猪,主要发病症状为家畜高热、神经症状、呼吸困难、孕畜流产、畸形胎甚至死胎,病畜产出弱仔后,其后代成活率很低。弓形虫病对我国养殖业危害巨大,在猪、牛、羊和鸡中均有该病报道,其中以猪的感染率最高。活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)是细胞中氧代谢的副产物,对细胞内多种通路的激活都有重要的意义。ROS在细胞中浓度较低时,会参与细胞信号转导过程,然而过多的ROS会使细胞发生氧化应激反应,细胞内氧化还原系统失衡,引起细胞内核酸、蛋白质和内脂质的氧化损伤,引发细胞损伤和细胞凋亡,最终导致组织器官损伤和细胞死亡。当弓形虫感染宿主细胞后,虫体蛋白或由其所引起的细胞因子会诱导宿主细胞产生过量的ROS,用于清除虫体,这也是天然免疫反应抵抗弓形虫感染的重要过程之一。但是过量的ROS对细胞生存具有毒性作用,此时由核因子E2相关基因2(NuclearFactorErythroid2-relatedfactor2,Nrf2)调控的基因表达后参与抗氧化应激的防御体系中,用以维持机体的氧化还原平衡,从而起到对细胞的保护作用。可是,目前弓形虫感染后是如何调控宿主细胞ROS水平的机理还尚不清楚P62蛋白是选择性自噬中重要的受体蛋白之一,同时作为信号转导的中心可以参与调节多种细胞通路,作为自噬受体蛋白被人们广泛认识。P62-Keap1-Nrf2信号通路作为非经典的抗氧化基因表达通路,可以启动多种具有细胞保护性抗氧化基因的转录表达。为针对猪抗病育种潜在基因靶点筛选工作,本研究利用RAW264.7细胞感染弓形虫RH株后检测Nrf2信号通路激活情况、ROS水平、宿主细胞自噬水平及Nrf2的抑制蛋白Keap1的变化情况。在此基础上,通过CRISP/Cas9技术、WesternBlot、Real-timePCR、流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察等技术手段,分析了Nrf2下游靶基因转录水平、Nrf2基因敲除细胞系的细胞活力状态、P62蛋白表达水平及其在细胞内的定位和弓形虫引起的细胞自噬水平等,得到的主要结果如下:(1)弓形虫感染后会引起RAW264.7细胞ROS水平上调且随着加弓形虫感染剂量增加ROS水平呈剂量依赖模式;(2)弓形虫感染RAW264.7细胞会激活Nrf2抗氧化信号通路,通过Real-timePCR检测Nrf2下游靶基因转录情况发现,弓形虫感染可以显著引起由Nrf2启动转录的下游细胞保护性基因HO-1(P<0.05)、GSTA-1(P<0.01)和NQO-1(P<0.05)的转录活性升高;(3)成功构建Nrf2敲除细胞系,在弓形虫感染的Nrf2基因敲除细胞系中,相较于野生型细胞,Nrf2抗氧化信号通路下游靶基因GSTA-1(P<0.001)和NQO-1转录水平显著下调(P<0.001),ROS表达呈上调趋势,且Nrf2基因敲除后会显著抑制IFN-γ和TNF-α诱导后的RAW264.7细胞内感染弓形虫的生长复制;(4)弓形虫感染会导致NIH/3T3(P<0.001)和HEK293T(P<0.001)细胞P62蛋白表达显著下调,RAW264.7(P<0.001)、THP-1(P<0.05)和原代小鼠细胞腹腔巨噬细胞P62蛋白表达显著上调,且缺失Nrf2核转录因子对弓形虫感染所引起的P62蛋白表达没有影响;(5)成功构建p62敲除细胞系,弓形虫RAW264.7细胞感染会激活P62调控的Nrf2抗氧化信号通路,通过Real-timePCR检测弓形虫感染的P62基因敲除细胞系中,相较于野生型细胞,P62抗氧化信号通路下游靶基因HO-1(P<0.05)、GSTA-1(P<0.001)和NQO-1(P<0.001)转录水平都显著下调;(6)弓形虫感染RAW264.7细胞会引起细胞自噬水平升高,通过WesternBlot分析显示,随着感染弓形虫时间的增加,自噬的Marker蛋白LC3-II蛋白表达呈显著上升趋势(P<0.05);(7)弓形虫感染RAW264.7细胞后,会通过P62介导的选择性自噬降解Keap1蛋白,从而激活Nrf2抗氧化通路,通过WesternBlot结果显示,在P62基因敲除细胞中,Keap1蛋白降解被抑制。总而言之,Nrf2信号通路对于维持活