凝血因子的分离纯化及抗血管性假血友病的抗血药制剂的制备

凝血因子的分离纯化及抗血管性假血友病的抗血药制剂的制备

凝血因子是由促进反应成分和相关vw组成的合成大学。甲型血友病患者FⅧ:C异常或缺乏,血管性假血友病(vWD)患者vWF异常或缺乏。FⅧ:C是FⅨa活化FX的辅因子。vWF为高分子量糖蛋白,是血小板粘附于内皮和内皮下的中介物,参与最初的血管止血过程。FⅧ:C极不稳定,它对vWF有一种依存关系,但两者又都有各自独立的生物学功能。当前已采用各种不同的方法制备FⅧ浓缩物以满足临床和研究工作的需要。我们通过3次预试验,确定了一种可行的纯化方法,得到了具有FⅧ各种活性的高纯度产品。1材料和方法1.1材料表面1.1.1血浆自采血经分浆到冻结在-25℃冰箱6小时内完成的新鲜冰冻血浆。1.1.2SephacrylS-1000,Pharmacia公司产品。1.1.3alcl3溶液的纯化0.3mol/LNaOH溶液逐滴加入0.1mol/LAlCl3溶液至pH7.0,静置片刻后离心,沉淀悬浮于适量的TrisHCl缓冲液中,凝胶的Al(OH)3浓度为3%。1.1.4缓冲区缓冲区1.1.4.1tris-hcl缓冲液1.1.4.2甘氨酸缓冲液2.8mol/L甘氨酸溶液含有0.3mol/LNaCl和0.025mol/LTris,用HCl调pH至6.8。1.1.4.cacl2、0.4mol2和1%蔗糖hcl0.02mol/L枸橼酸钠溶液,含有0.005mol/LCaCl2、0.04mol/LNaCl和1%蔗糖,用HCl调pH至7.1。1.1.4.4层析缓冲区55mmol/L枸橼酸钠溶液用55mmol/L枸橼酸调pH至7.4,加入NaN3至0.02%。1.2方法1.2.1f.f：c测试1.2.2观察方法血小板悬液对Olson方法作一些改进。新鲜洗涤浓缩血小板,计数为250×109/L。用Chrono-Log400型血小板聚集仪进行测定。血小板悬液0.35ml,自制60人份混合标准血浆或被检样品0.10ml于聚集仪(37℃)中孵育3min后加入0.05mlRistocetin(H.LundeckA/S-Copenhagen,丹麦)溶液,最终浓度为1mg/ml,观察描记5min。以5min时聚集峰高与标准血浆稀释度在双对数座标纸上作出标准线,并制定标准血浆的FⅧR:RCof为1U/ml,被检样品结果由此算出。1.2.3测定蛋白质含量的测定1.2.4f.r：ag，Fg、Fn、IgG含量均采用火箭电泳进行测定。将自制标准血浆中以上成分的含量定为1U/ml。抗血清均购自上海生物制品研究所。1.2.5准备过程1.2.5.枸杞酸钠溶液的提取4000ml血浆,置流动自来水浴中融化至含少许冰屑,4℃离心,收集冷沉淀。将冷沉淀悬浮于240mlTris-HCl缓冲液中,在室温下搅拌抽提。然后加入16mlAl(OH)3凝胶,继续搅拌5min,15℃离心,上清液澄清过滤后加入0.5mol/L枸橼酸钠溶液至终浓度为0.02mol/L。用HCl调pH至6.95,得中纯FⅧ260ml。1.2.5.离心液-nacl-ms/gc中纯FⅧ加入甘氨酸缓冲液至甘氨酸终浓度为2mol/L,搅拌15min,静置10min,室温400g10min离心。上清液中加入固体NaCl至终浓度为10%。搅拌15min,静置10min,离心后的沉淀溶解于20ml溶解缓冲液中。再离心去掉不溶物,上清则为高纯FⅧ。1.2.5.高纯f上样和含fnSephacrylS-1000装柱(2.6×40cm),用层析缓冲液平衡过夜。高纯FⅧ上样速度为100ml/h,以60ml/h的速度洗脱。收集富含FⅧ:C及FⅧR:RCof部分。层析图谱见图1,纯化流程见图2。2结果2.1表1显示了在血浆和纯度过程中各阶段产品的蛋白质组成分析2.2表2显示了每个步骤中有机原料血浆的提取多样性和回收率3治疗分型血友病和vwd的f产品层析前的纯化过程可得到3种产品:冷沉淀、中纯FⅧ和高纯FⅧ。整个工艺具有较好的衔接性,并且能很好地与巴斯德消毒法或有机溶剂-去污剂灭活病毒的方法结合起来,放大规模用于常规生产,向临床提供无病毒的安全制品。无论是甲型血友病患者或vWD患者均需长期使用FⅧ制品进行替代治疗,因此提高FⅧ制品的纯度,尽量减少同种异源杂蛋白(Fg、Fn、IgG)的输入是制备FⅧ的努力方向。我们通过SephacrylS-1000分子筛层析在这方面作了有益的尝试。层析后的产品富含FⅧ:C/vWF,杂蛋白含量甚微(火箭电泳未测出),可用于治疗甲型血友病和vWD;它还可作为纯抗原用于免疫动物,获取FⅧC:A