宏基因组(mNGS)在感染性肺部疾病的临床应用

宏基因组测序在感染性肺部疾病的临床应用20201112ClinicalApplicationofMetagenomicSequencinginInfectiousLungDisease目录CONTENTS1234背景概述宏基因组研究进展病例分析Part章节01背景概述BACKGROUNDOVERVIEW背景概述BACKGROUNDOVERVIEW不明原因发热分析80%-90%感染性疾病10%FUO发热感染性疾病自身免疫性疾病肿瘤不明原因45%-55%20%-30%10%-20%~10%不明原因发热（feverofunknownorigin，FUO）发热时间持续超过3周；体温多次超过38.3℃；超过1周完整的病史询问、体格检查和常规实验室检查后仍不能确诊。参考《不明原因发热与普通发热待查的回顾性比较分析》，2014年，临床和实验医学杂志背景概述BACKGROUNDOVERVIEW初步检查明辨方向：感染性？非感染性？培养+药敏细菌、真菌、结核、病毒等培养物：血、骨髓、尿、痰、咽拭物、引流物、各种体液、置入导管等病原血清学检查呼吸道病原体IgM/IgG，G/GM/GXM/Mn试验，CMV、TB-IGRA，EBV、HIV抗体，弓形虫抗体、寄生虫抗体等分子生物学检查TBGeneX-pert、CMV-DNA、EBV-DNA形态学检查各种标本的涂片染色、大便找虫卵、找霉菌、疟原虫等二代测序

宏基因（mNGS）、感染病原体基因检测panel常规检查病原学检查风湿免疫检查血液系统检查肿瘤学检查影像学检查病理学检查背景概述BACKGROUNDOVERVIEW背景概述BACKGROUNDOVERVIEW女性HIV死亡比率14.4%，其余感染性疾病死亡比率12.6%男性HIV死亡比率10.7%，其余感染性疾病死亡比率9.5%背景概述BACKGROUNDOVERVIEW图6不同地区肺炎链球菌对红霉素耐药率图13不同地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率背景概述BACKGROUNDOVERVIEW

抗感染药物滥用已成为影响人类健康的主要威胁。我国于2016年发起“遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)”但避免抗感染药物滥用、遏制细菌耐药的关键在于感染性疾病病原菌的早期、快速、精准诊断。

图1、2特殊与重要耐药细菌检出率分析对头孢噻肟耐药大肠埃希菌甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药铜绿假单胞菌碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌万古霉素耐药屎肠球菌青霉素耐药肺炎链球菌碳青霉烯类耐药大肠埃希菌2018年全国细菌耐药监测报告.Part章节02宏基因组METAGENOME宏基因组METAGENOME广泛应用于人体微生物与疾病研究领域；在临床产前诊断、癌症个体化治疗领域快速推广2013/11IlluminaMiseqDX通过美国FDA认证2014/03卫计委启动无创唐筛等二代测序检测临床申报2015/01卫计委发布《遗传病相关个体化医学检测技术指南（试行）》《测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）》2015/02卫计委公布首批基因测序临床试点单位2015/07卫计委发布《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》病原微生物高通量测序临床检测？宏基因组METAGENOME宏基因组METAGENOME宏基因组METAGENOME研究进展RESEARCHPROGRESSAJRCCMArticlesinPress.Publishedon05-May-2017as10.1164/rccm.201703-0537LE宏基因组METAGENOME宏基因组检测的优势快检测周期准敏感性与特异性全种类与数量实验室周转周期<24h1、采用PCR-free建库技术，避免PCR引入的偏向性和污染；2、优化核酸提取方案，解决真菌和分枝杆菌难破壁，检出率低的问题；3、采用Matridx-Spike质控技术，每个样本设立独一内标，避免交叉污染1、覆盖16000余种病原体；2、报告表型明确、提示显著临床指导意义的耐药基因；3、DNA+RNA可同时检测，不放过任何潜在病原体。技术优势Part章节03研究进展RESEARCHPROGRESS研究进展RESEARCHPROGRESS2016年美国FDA发布mNGS感染检测产品指南(草案)2018年mNGS写入中国成人HAP与VAP诊断和治疗指南

2018年mNGS可用于儿童呼吸道感染诊断(细菌、病毒)2019年mNGS在急危重症感染应用的专家共识宏基因mNGS项目迅速被临床认可研究进展RESEARCHPROGRESS研究进展RESEARCHPROGRESS

MoranLosada等运用临床宏基因组学的方法检测不同年龄阶段的囊性肺纤维化患者的诱导痰液样本证实99%的呼吸道微生物是数百种细菌主要以铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌为主真菌及病毒仅占呼吸道微生物的1%左右，真菌主要为念珠菌和曲霉菌，病毒主要为腺病毒和疱疹病毒该研究同时明确每例呼吸道样本中每种微生物的丰度。研究进展RESEARCHPROGRESS

Langelier等纳入22例因下呼吸道感染入院的骨髓移植患者，运用临床宏基因组学的方法检测每位患者250μl的肺泡灌洗液样本，结果显示急性呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在HCOV-229E、HRV-A、HHV-6、CMV、HSV、EBV、人乳头瘤病毒及扭矩特诺病毒等多种病毒，同时存在少见的致病性细菌：轻型链球菌及棒状杆菌，且细菌与病毒共存患者临床症状明显较重。研究进展RESEARCHPROGRESSmNGS在呼吸道感染诊断中的临床研究mNGS用于检测92例下呼吸道感染、急性呼吸衰竭成人的气管抽吸液样本，检出率大大超过传统方法。Langelieretal.PNAS,2018研究进展RESEARCHPROGRESS重症肺炎研究N=178例，研究mNGS早期提供病原学证据和ICU重症肺炎患者生存情况：通过mNGS早期明确诊断后，临床据此结果调整治疗方案，患者28天和90天的生存率均有提高；与传统方法相比，mNGS可以提供更快速准确的病原学结果，尤其是对苛养的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、产黑色普氏菌诊断价值明显，同时在混合感染的诊断上也具有明显优势。研究进展RESEARCHPROGRESS

相对于传统的微生物培养技术，临床宏基因组学在呼吸道样本微生物诊断的特异性高达99.8%~100%；脑脊液样本中，临床宏基因组学的微生物诊断敏感性和特异性分别达到84.3%和93.7%。研究进展RESEARCHPROGRESS临床宏基因组检测适应症病情危重需要尽快明确病原体特殊病人如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者需要尽快明确病原体传统微生物检测技术反复阴性且治疗效果不佳疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性疑似特殊病原体感染长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染项目送检要求RESEARCHPROGRESS临床表现样本类型样本量容器肺部感染：不明肺炎、胸痛、胸腔积水、胸透异常肺泡灌洗液、胸水、肺部组织、痰液、咽拭子肺泡灌洗液、胸水、痰液：3ml肺部组织：>3mm*5mm咽拭子：>1拭子无菌带旋盖脑部感染：神经性症状脑脊液2ml无菌带旋盖器官脓肿脓肿抽液、体液、人体组织2ml无菌带旋盖骨髓炎组织、抽液2ml无菌带旋盖风湿炎、关节炎关节抽液2ml无菌带旋盖伤口长期无法愈合伤口渗出液>1个拭子拭子保存液组织部位感染组织>3mm*5mm无菌带旋盖不明原因发热、血流感染血液宏基因组检测：4mlEDTA抗凝管项目介绍RESEARCHPROGRESS

基于二代高通量测序技术，对患者感染的病原体进行快速、高效的鉴定。主要是通过测序、数据清洗、错误探查和数据库比对分析等一系列操作，获得疑似病源微生物的种属信息，并经过权威临床微生物专家的深度解读，提供全面深入的分析检测报告并辅助临床诊断和治疗决策。医嘱项目检验指标病原体临床意义标本采集报告时间感染病原体宏基因组检测病原体DNA细菌8000+真菌2000+DNA病毒2000+寄生虫1000+衣原体100+支原体100+螺旋体100+立克次体100+病原体感染种类诊断见标本采集要求3-5个工作日病原体感染种类诊断见标本采集要求感染病原体宏基因组检测(加强版)病原体DNA同上+RNA病毒3-5个工作日耐药性检测项目介绍可能原因：1、诊断错误：肺不张、肺栓塞、肺出血、新生物等；2、临床样本未采集到病原体，不是病灶部位标本；3、抗生素使用使临床样本内的病原丰度降低至检测限以下；4、病原为RNA病毒，但是只做了DNA。临床怀疑是感染，但mNGS检测为阴性可能原因：1、抗生素使用不对；2、并发症：肺脓肿或积脓、隐匿性的感染、药物热等；3、诊断错误：肺不张、肺栓塞、肺出血、新生物等；4、耐药。依据mNGS检测结果去用药，但治疗无反应？mNGS结果如何结合临床进行评判?检出的病原体：报告只能给出病原体，是定值菌、背景菌还是致病菌，需要结合临床；有无临床感染证据：有无发热，感染的症状、体征；实验室检查：结合患者的血象、血沉、CRP、PCT、IL-6，镜检结果，培养结果，血清学检查；结合影像学改变：影像学改变是感染的重要证据；检测方法：mNGS技术的方法。mNGS众多的阳性结果（一堆病原体）如何解读？背景常见菌：葡萄球菌、丙酸杆菌、莫拉菌、棒状杆菌、嗜血杆菌、罗氏菌属、普氏菌属、纤毛菌属检测阳性≠致病病因阴性报告价值1、多病原体列表展示的优势作用在于提供可能的有效线索；2、开发特征基因数据库和大样本背景数据积累，将会进一步明确检出病原与疾病的关联性。1、治疗前：结合病人情况排除感染或病原体本身含量很低；2、治疗后：用药后取样导致病原体含量降低。严格致病病原体：如结核、奴卡菌、流感病毒、曲霉、支原体等，可考虑为致病病原；条件致病菌：铜绿、鲍曼、肺克、链球菌等，要看测到的序列数，以及排名，结合临床来判断；多种病原体混合感染：多病原感染，或呼吸道分泌物、肠道分泌物开放体系本身的微生物多样性等原因会导致多种病原体检出；常见定值菌：一般不考虑致病性，除非序列数特别高；罕见、特殊病原