2叶绿体分离、离体叶绿体还原活性

个人收集整理资料，仅供沟通学习，勿作商业用途个人收集整理资料，仅供沟通学习，勿作商业用途8????8试验五叶绿体的分别、离体叶绿体的复原活性一、试验目的制备具有活性的离体叶绿体和测定希尔反响活力是争论叶绿体构造功能和光合作用机理的重要技术条件。本试验通过学习分别制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反响的理解及对光反响的生疏。二、试验原理光合作用机制是一个比较简洁的问题，可分为光反响和暗反响，大致分为三大步骤：<1〕原初反响<光能的吸取、传递和转换过程〕；<2〕电子传递和光合磷酸化<电能转变为活泼的化学能〕；<3〕碳同化<活泼的化学能转变为稳定的化学能〕。光反响中，由水至NADP+的电子传递是由两个反响中心PSⅡ和PSPSⅡ的一个重要功能是利用光能使水裂解放氧。b5E2RGbCAP2H2O 光子 O2+4H++4e-英国生物化学家Hill<1937〕首先将离体叶绿体参与有适当氢受体<如草酸高铁钾盐，2,6-二氯酚靛酚，NAD+和NADP+〕的水溶液中，照光后即有O2放出，这就是水的光解，即希尔反响。p1EanqFDPw叶绿体的分别承受离心分级分别，即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，后用高速离心沉降叶绿体。希尔反响活力的测定是将叶绿体参与氢受体，并照光，水被光解放氧，溶液颜色发生变化，通过比色测定。DXDiTa9E3d三、试验材料颖菠菜叶片。四、设备与试剂分光光度计，离心机，照光装置<2500W〕，试管，移液管，烧杯，纱布，研钵等。0.35MNaCl溶液、0.01MTris溶液五、试验步骤1、离体叶绿体的制备：称鲜菠菜叶5g，加10ml0.35MNaCl、1mlTris缓冲液、石英砂，研磨。匀浆用脱脂棉过滤。1000/53000/5去除上清液，保存沉淀。5ml0.35MNaCl，搅匀，得到叶绿体悬浮液。2、希尔反响活力的测定依据下面表格，取三支试管，分别进展不同的操作。3620nm60cm管号0.1mlTris缓冲液叶绿体煮沸2.6-二氯吲哚叮酚19.3ml管号0.1mlTris缓冲液叶绿体煮沸2.6-二氯吲哚叮酚19.3ml0.2ml——0.5ml29.3ml0.2ml5min0.5ml39.8ml0.2ml————六、试验结果2管号12345123将所测光值记录到上表，画出曲线图，并分析缘由。七、留意事项1、2.6-二氯吲哚叮酚必需在煮沸加热后滴加。2、溶液参与比色杯就开头计时。3、每次测光时都应调零和百分比。4、试管加热时管口不要对准他人。八、思考题1.试管中蓝色褪去的缘由是什么?与光照有什么关系?2 ． 煮 沸 对 叶 绿 体 有 何 影 响 ？3．请对结果作出解释。RTCrpUDGiT附录1：离心机的构造及使用离心机是利用离心力对混合液<含有固形物〕进展分别和沉淀的一种专用仪器。试验室常用电动低速离心机、高速离心机和低速、高速冷冻离心机，以及超速分析、制备两用冷冻离心机等多种型号。其中以低速<包括大容量〕离心机和高速冷冻离心机应用最为广泛，是生化试验室用来分别制备生物大分子必不行少的重要工具。5PCzVD7HxA在试验过程中，欲使沉淀与母液分开，常使用过滤和离心两种方法。在下述状况下，使用离心方法效果较好。沉淀有粘性或母液粘稠。沉淀颗粒小，简洁透过滤纸。沉淀量过多而疏松。沉淀量很少，需要定量测定。或母液量很少，分别时应削减损失。沉淀和母液必需快速分开。一般胶体溶液。电动低速离心机的根本构造和性能低速离心机构造较简洁，可分小型台式和落地式两类，配有驱动电机、调速器、定时器等装置，操作便利。低速离心机其转速一般不超过4000rpm，台式高速离心机最大转速可达18000rpm。jLBHrnAILg离心机的一般使用规程1、离心前，先将离心的物质转移入适宜的离心管中，其量以距离管口1~2cm为宜，以免在离心时甩出。将离心管放入外套管中，在外套管与离心管间注入缓冲水，使离心管不易破损。xHAQX74J0X2、取一对外套管<内已有离心管〕放在台秤上平衡。如不平衡，可调整缓冲用水或离心物质的量。将平衡好的套管放在离心机十字转盖。LDAYtRyKfE3、接通电源，开启开关。4、待离心机自行停顿转动手，翻开机盖，取出离心样品。5、将外套管、橡胶垫冲洗干净，倒置枯燥备用。留意事项1、低速离心机要放在平坦和结实的地面或试验台上，不允许倾斜。2、一年检查一次电动机的电刷及轴承磨损状况，必要时更换电刷或轴承。3、关闭电源后，要等候离心机自动停顿。不允许用手或其他物件迫使 离 心 机 停 转 4、离心机应接地线，以确保安全。 5、离心机启动后，如有不正常的噪音及振动时，可能离心管裂开或相对位置上的两管重量不平衡，应马上关机处理。Zzz6ZB2Ltk2：721吸取光谱原理物质中分子内部的运动可分为电子的运动、分子内原子的振动和分子自身的转动，因此具有电子能级、振动能级和转动能级。当分子被光照耀时，将吸取能量引起能级跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。而三种能级跃迁所需能量是不同的，需用不同波长的电磁波去激发。电子能级跃迁所需的能量较大，一般 在1eV～20eV，吸取光谱主要处于紫外及可见光区，这种光谱称为紫外及可见光谱。假设用红外线(能量为1eV～0.025eV>照耀分子，此能量缺乏以引起电子能级的跃迁，而只能引发振动能级和转动能级的跃迁，得到的光谱为红外光谱。假设以能量更低的远红外线(0.025eV～0.003eV>照耀分子，只能引起转动能级的跃迁，这种光谱称为远红外光谱。由于物质构造不同对上述各能级跃迁所需能量都不一样，因此对光的吸取也就不一样，各种物质都有各自的吸取光带，因而就可以对不同物质进展鉴定分析，这是光度法进展定性分析的基础。dvzfvkwMI1依据朗伯—比耳定律:当入射光波长、溶质、溶剂以及溶液的温度确定时，溶液的光密度和溶液层厚度及溶液的浓度成正比，假设液层的厚度确定，则溶液的光密度只与溶液的浓度有关，rqyn14ZNXIITε为摩尔消光系数，lEmxvxOtOco在待测物质的厚度l确定时，吸光度与被测物质的浓度成正比，这就是光度法定量分析的依据。分光光度计的构造原理将一束复合光通过分光系统，将其分成一系列波长的单色光，任意选取某一波长的光，依据被测物质对光的吸取强弱进展物质的测定分析，这种方法称为分光光度法，分光光度法所使用的仪器称SixE2yXPq572721752型等。各种型号的分光光度计的根本构造都一样，由如下五局部组成:6ewMyirQFL源>；⑤信号指示系统(检流计、微安表、数字电压表、示波器、微处理机显像管>。光源→单色器→样品吸取池→检测系统→信号指示系统2.分光光度计的使用方法在仪器尚未接通电源时，电表指针必需于“0”刻线上，假设不是这种状况，则可以用电表上的校正螺丝进展调整。将仪器电源开通，翻开比色皿暗箱盖，选择需用的波长，然后将比色皿暗箱盖合上，比色皿座处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，旋转调“100%”电位器，使电表指针到满度四周，仪器预热20分钟。放大器灵敏度有五档，是逐步增加的，“1”最低。其选择原100%”的状况下，尽可能承受灵敏1”，灵敏度不够时再渐渐上升，但转变灵敏度后需按“4”重校正“0