本科生《》第五章目的基因制备与克隆策略

《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》

《基因工程原理》Professor,Dr.Degang

Zhao(赵德刚)GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,

CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity

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第五章基因工程工具酶TheTooloftheGeneEngineering

教学目的与要求：1）掌握II型限制性核酸内切酶的切割原理，和部分常用识别位点。2）掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。3）了解DNA连接酶和修饰酶在基因操作中的用途。2第一节目的基因的制备

3目的基因（TargetGene）：指基因工程中需要进行制备、克隆或利用的基因。制备目的基因要根据需要获得DNA片段，可能是启动子、终止子、内含子，或者是编码某种蛋白完整的序列。目的基因制备方法有直接分离法、基因文库筛选法、PCR扩增法以及化学合成法等。一、目的基因的直接分离法1．限制性核酸内切酶酶切分离法这是最简单的获取目的基因的方法，主要是从质粒、病毒等比较简单的DNA分子或基因组中分离目的基因。无论是已知序列或是尚未测序的序列都可进行分离，只要确定目的基因两侧的酶切位点，就可用相应的酶进行切割，获得目的基因。42.基因分离的物理化学法其原理是根据基因的DNA分子两条链GC含量差异较大，理化性质、包括浮力密度和解链温度明显不同所采用相应的方法进行分离。（1）密度梯度离心法将DNA切割成适当片段，富含GC的双链DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速离心技术，可将DNA片段按不同密度大小分开。（2）单链酶解法基因GC含量高（三个氢键），Tm值高，热稳定性高，可通过控制解链温度使富含A=T区变性解链，GC区维持双链状态，再利用单链核酸酶S1酶切单链部分，获得富含GC的基因片段。（3）分子杂交法利用DNA单链易与互补链形成双链的原理，将已知基因DNA与目的生物的DNA进行复性，再用单链核酸酶S1酶切除单链，留下的双链即为目的基因序列53.双抗体免疫法分离编码蛋白基因

基因翻译过程中，核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体。利用多肽链制备的抗体及二抗，与多聚核糖核蛋白体一起温育，目的基因的多聚核糖核蛋白体将通过抗原抗体反应与相应抗体形成复合物，利用不连续蔗糖梯度离心将此复合物分离出来，再通过酚/仿抽提法出去蛋白质部分，过oligo-dT柱层析，即可分离出特定蛋白编码的mRNA，反转录即可得到cDNA。目前，可用金黄色葡萄球菌中分离的proteinA代替二抗，再用proteinA-Sepharose4B作亲和层析，分离出特定的多聚核糖体（代替密度梯度离心）。

64．利用酶促反转录直接从特定mRNA分离基因此法是在目的基因的mRNA占细胞中总mRNA量很大时采用，直接用逆转录酶合成cDNA，与载体重组后导入受体菌扩增，获得目的基因的cDNA克隆。如哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA占总mRNA的90%以上，用此法克隆了该基因。75．构建基因文库分离目的基因基因文库分基因组文库和cDNA文库。基因文库可用质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒（cosmid）载体和酵母人工染色体（YAC）载体进行构建。从基因组文库可以分离获得基因编码序列、调控序列、启动子、终止子、核糖体识别mRNA序列、ARS、端粒序列、间隔序列等，可用于基因结构分析、基因表达和调控研究等。cDNA文库来自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表达的转录及加工后mRNA产物所携带的信息，所以从cDNA文库可以分离到基因的编码序列。8筛选基因文库的方法：①已知基因序列，可以人工合成核酸探针，通过核酸杂交，从基因文库中筛选出含目的基因的克隆。②已分离纯化某蛋白，并知其氨基酸序列，根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作为探针，筛选基因文库。③已纯化某蛋白，未能测出其氨基酸序列，可以该蛋白制备抗体，从cDNA表达文库中筛选出含该蛋白编码基因的克隆。④对编码产物未知的基因，采用特殊分离方法如差别显示技术、差减杂交法、遗传互补法等。9遗传互补法（功能互补法）原理：当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。营养缺陷型受体细胞+外源DNA→转化细胞涂布在合成培养基上→原养型细胞生长受体细胞（无某种表型）+外源DNA→转化细胞涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。实例：基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因组文库DNA→转化E.coli（无纤维素酶活性）→转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈→纤维素酶基因10核酸杂交法（同源序列克隆法）：（1)原理利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因。（2)核酸探针种类①DNA探针:分离自某一种生物。②寡核苷酸探针:根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测，人工化学合成。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN对应mRNAN：ACGT/UCAN-AAP-GTP-CTP-CG探针序列Q：CT/UP：AG32种14聚体的混合物，其中必有一种与待测DNA完全互补。cDNA探针:利用特异性mRNA反转录而成，亦可用不同mRNA混合物反转录而成。RNA探针:由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得。11分离步步骤：：基因因文库库→→制备备DNA样样品膜膜→与与标记记探针针杂交交→→杂交交斑点点（阳阳性克克隆））→分分离重重组DNA分子子→→作作斑点点和Southern杂杂交以以确认认杂交交结果果→→DNA进一一步证证实和和鉴定定：核核酸序序列分分析，，与蛋蛋白质质一级级结构构比较较；分分离插插入片片段进进行基基因表表达，，用免免疫方方法或或其他他方法法检测测表达达产物物。6．特特异性性DNA片片段(基因因)的的PCR扩扩增124．目目的基基因的的化学学合成成法（1））核酸酸片段段化学学合成成有磷酸酸二酯酯法、、磷酸酸三酯酯法和和亚磷磷酸三三酯法法，反反应体体系有有液相相和固固相。。目前前常用用的方方法是是固相相亚磷磷酸三三酯法法。第第一个个核苷苷酸的的3`端通通过3`羟羟基与与惰性性固相相载体体上的的间隔隔臂形形成酯酯健，，寡核核苷酸酸按3`-5`方向向进行行化学学合成成，正正常终终产物物是3`、、5`端均均带有有羟基基的寡寡聚核核苷酸酸。合成原原料：：经化化学修修饰的的核苷苷—亚亚磷酰酰胺。。有两两种类类型：：①甲甲基基化亚亚磷酰酰胺；；②ßß-氰乙乙基-亚磷磷酰胺胺。合合成时时要对对羟基基、磷磷酸、、氨基基进行行保护护，合合成结结束后后，去去掉所所有保保护基基团。。固相载载体：：是对对DNA合合成试试剂惰惰性的的物质质，目目前采采用可可控孔孔径的的玻璃璃沙（（CPG））,其其表面面的硅硅氧烷烷键可可与A、G、C、T核苷苷的3`-羟基基以酯酯键连连接，，该键键可用用29%浓浓氨水水打断断。13反应分分四步步：1）二甲氧氧三苯苯甲基基（DMT，羟羟基保保护基基团））的脱脱除用用三氯氯乙酸酸（TCA）或或二氯氯乙酸酸（DCA）处处理，，脱去去连在在固相相载体体上的的核苷苷酸或或寡核核苷酸酸5`羟基基的DMT保护护基团团。2）偶偶联反反应（（缩合合反应应，加加成反反应））由由溶溶于无无水乙乙腈中中的四四唑催催化，，使亚亚磷酰酰胺单单体的的3`磷酸酸基团团与固固相载载体上上的5`羟羟基发发生反反应，，形成成亚磷磷酸三三酯键键。3）封封闭反反应加加成反反应剩剩下的的亚磷磷酰胺胺，以以N-甲基基眯唑唑催化化，用用乙酸酸酐使使羟基基乙酰酰化，，封闭闭其羟羟基，，防止止在下下一循循环中中发生生加成成反应应。4）氧氧化反反应在在碱性性条件件下，，以碘碘使加加成反反应形形成的的3`，5`亚亚磷酸酸三酯酯键氧氧化为为稳定定的5价磷磷酸三三酯。。上述每每循环环一次次，增增加一一个核核苷酸酸，需需7~9min。每每一步步反应应完成成都以以乙腈腈清洗洗，氩氩气吹吹干，，保证证无水水环境境。合合成反反应结结束后后，除除去保保护基基团，，29%浓浓氨水水处理理使寡寡聚核核苷酸酸从载载体上上释放放出来来，乙乙醇或或异丙丙醇沉沉淀、、回收收DNA。。用RNA亚亚磷酸酸胺单单体和和聚苯苯乙烯烯固相相载体体，合合成RNA。14（2））化学学合成成DNA片片段种种类①DNA互互补链链合成成引物物包包括PCR引物物和测测序引引物。。②DNALinker预预先先设计计，通通过化化学合合成的的寡聚聚核苷苷酸片片段，，含有有1种种或几几种酶酶切位位点，，酶切切可产产生粘粘性末末端。。如果果将含含有多多个酶酶切位位点的的Linker引引入克克隆载载体中中，就就会形形成多多克隆隆位点点（MCS），，这种种具有有多克克隆位位点的的连杆杆称MCSLinker。。③Adaptor是是一种化学学合成的寡寡聚核苷酸酸，含有一一种以上的的内切酶位位点。其与与Linker的差差别是Adaptor一端或或两端已有有1种或两两种内切酶酶切割产生生的粘性末末端。④DNA芯片片 指DNA片段以以事先设计计的排列方方式固定在在载波片或或尼龙膜上上组成的密密集分子排排列。固定定的是探针针，或者是是靶DNA分子。15（3）目的的基因的化化学合成法法1979年年，Khorana等首次化化学合成基基因有生物物活性。有有全片段酶酶促连接法法和酶促填填充法。165．利用表表达序列克克隆目的基基因（1）表达达序列标签签法分离目目的基因Expressedsequencetag，简称称EST：指基因序序列中一段段能特异地地标记或表表征基因的的序列，通通常它含有有足够的结结构信息以以显示出该该基因与其其他基因的的差异，长长度一般为为100~500bp。利利用EST寻找新基基因的策略略即为表达达序列标签签法（ESTs）。。最早由M.D.Adam在1991年建建立并加以以应用，有有的文献称称之为cDNA测测序法。基本步骤如下下：①从组织特特异性或细胞胞特异性的cDNA文库库中随机挑选选克隆，进行行5‘端和3’端部分序序列（约400bp））的测定。。②通过对对GenBank、EMBL或其他他核苷酸序列列数据库进行行联机检索，，可以检测出出所测定序列列及其对应的的多肽氨基酸酸序列。将检检测的序列与与基因库中已已知基因进行行同源比较，，可检测到已已知基因和未未知基因。③③通过基因因文库的筛选选或基因定位位的方法分离离目的基因。。表达序列标签签法分离目的的基因有时可可以从几个不不同基因的高高度保守区得得到相同的cDNA片断断，有时一个个较大的基因因不同外显子子又能表现为为若干不同的的cDNA。。17（2）计算机机克隆(siliconcloning)或或生物信息学学(bioinformatics)克隆新基基因策略生物信息学克克隆新基因策策略是表达序序列标签法的的延伸和发展展。生物信息息学与计算机机科学、信息息学等学科相相互交叉而诞诞生的一门新新兴学科，核核心内容是通通过对生物学学实验数据的的获取、加工工、存储、检检索与分析，，进而达到揭揭示数据所蕴蕴含的生物学学意义的目的的。做法：利用已发现的的其他物种基基因的cDNA序列为参参照，在国际际互联网的EST数据库库（GebBank或EMBL等））中进行同源源搜索，获得得一系列同源源的或部分重重叠的EST序列，然然后用GCG、DNAstar软软件中的alignment程序序将它们拼接接成一个EST重叠群群(contig)，经经过逐步延伸伸（cDNAsalking)及及整合后可获获得全长的cDNA序序列；根据该该推测的序列列，可合成相相应的特异引引物，进行PCR扩增增后，即可获获得该基因的的cDNA片片断。局限性：难以寻找到一一些表达量极极低或者不表表达的新基因因类型，克隆隆基因的功能能也有待鉴定定。18（3）基因表表达系列分析析法基因表达系列列分析法(serialanalysisofgeneexpression,简简称SAGE)可一次对大大量基因转录录产物进行定定量分析，从从中找出新的的基因。原理（两个）：①①从转录物物某一特定位位置上分离得得到一段9~10bp的的寡核苷酸酸序列标签(sequencetag,ST)，它含含有确定的一一个独特转录录物的足够信信息量，可代代表此转录物物的特异性。。理论上随机机排列的9bp片断可区区分262144（49）种转转录物，人类类的基因约仅仅有80000个转录录子，因此，，9个核苷酸酸序列可以代代表所有转录录子的特征。。②多个序序列标签（ST）能以锚锚定酶(anchoringenzyme,AE，，识别位点为为4碱基的限限制性核酸内内切酶)识别别位点序列相相隔相互连成成双标签序列列(ditag)的多联联体，将该多多联体序列克克隆到一个载载体中，用连连续的方法进进行多联体序序列分析，再再通过计算机机处理，确定定每一种序列列（ST）代代表转录产物物的种类和出出现频率，由由此实现对转转录物的高效效、快速和大大量的分析。。196．筛选目的的基因片断的的差别杂交及及减法杂交技技术（1）差别杂杂交法差别杂交（differentialhybridization）或称为差差别筛选(differentialscreening)法，特别适用于分分离在特定组组织中、发育育的特定阶段段表达的基因因以及受生长长因子调节的的基因，亦可可有效地用来来分离经特殊殊处理诱导表表达的基因。。方法是分别制制备两种不同同细胞群体的的mRNA提提取物，其其中一个群体体含有一定比比例的目的基基因mRNA，另一个群群体不含有目目的基因mRNA。以这这两种总mRNA（或是是它们的cDNA拷贝贝）为探针，，分别对由表表达目的基因因的细胞群体体构件的cDNA文库进进行筛选。20（2）减法杂杂交技术减法杂交（subtractivehybridization）又叫做差差减杂交克隆隆、扣除杂交交、减数杂交交或消减杂交交等，该技术术是通过DNA复性动力力学原理富集集目的基因序序列，并以此此构建减数文文库(subtractivelibrary)的方式式来进行目的的基因克隆。。减法杂交的的对象可以是是DNA，也也可以是cDNA，相相应地称为基基因组DNA减法杂交交和mRNA减法杂交。。后者分析差差异表达的基基因，适于某某些低丰度mRNA的cDNA克克隆。mRNA减法法杂交原理：：从表达目的基基因的组织中中提取mRNA并反转录录为cDNA，然后与无无目的基因表表达的组织中中提取mRNA做过量杂杂交，在两种种组织中均表表达的基因产产物形成cDNA/mRNA双链链杂交分子，，而特异mRNA反转录录的cDNA片段仍保持持单链状态，，将这种单链链cDNA分分离出来即为为差异表达的的序列。21（3）基因表表达系列分析析法基因表达系列列分析法(serialanalysisofgeneexpression,简简称SAGE)可一次对大大量基因转录录产物进行定定量分析，从从中找出新的的基因。原理（两个）：①①从转录物物某一特定位位置上分离得得到一段9~10bp的的寡核苷酸酸序列标签(sequencetag,ST)，它含含有确定的一一个独特转录录物的足够信信息量，可代代表此转录物物的特异性。。理论上随机机排列的9bp片断可区区分262144（49）种转转录物，人类类的基因约仅仅有80000个转录录子，因此，，9个核苷酸酸序列可以代代表所有转录录子的特征。。②多个序序列标签（ST）能以锚锚定酶(anchoringenzyme,AE，，识别位点为为4碱基的限限制性核酸内内切酶)识别别位点序列相相隔相互连成成双标签序列列(ditag)的多联联体，将该多多联体序列克克隆到一个载载体中，用连连续的方法进进行多联体序序列分析，再再通过计算机机处理，确定定每一种序列列（ST）代代表转录产物物的种类和出出现频率，由由此实现对转转录物的高效效、快速和大大量的分析。。第二节目的的基因克隆没有任何一种种克隆方法能能够涵盖所有有好处，克隆步骤：1）克隆一个个基因的方法法：cDNA合成限制性核酸内内切酶消化机械剪切Mechanicalshearing2）加到载体体上：选择寄寄主和载体系系统平末端连接Blunt-endligation使用连接头Useoflinkermolecules粘性末端连接接Ligationofcohesivetermini同聚物尾巴Homopolymertailing3）IntroducingtherecombinantDNAintoahostcell：：重组质粒转化化TransformationwithrecombinantplasmidDNA重组噬菌体DNA转染TransfectionwithrecombinantphageDNADNA体外包包装PackagingDNAinvitroChapter6第二节目的的基因克隆ThereisnosinglecloningstrategythatwillcoverallrequirementsA.GenerationofgenefragmentB.JoiningtoavectorC.IntroducingtherecombinantDNAintoahostcellcDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingChoosethehost/vectorsystemBlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolymertailingLigationofcohesiveterminiTransformationwithrecombinantplasmidDNATransfectionwithrecombinantphageDNAPackagingDNAinvitrocDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingDirectChemicalsymthesisPackagingDNAinvitroTransformationwithRecombinantPlasmidDNATranfectionwithRecombinantPhageDNABlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolyertailingLigationofCohesiveterminiGenerationofgenefragmentChoosethehost/vectorsystemIntroducingtherecombinantDNAintoahostcellChapter6★看家基因（Housekeepinggenes）：又称管家基基因或持家基基因：在所有有细胞中均要要表达的一类类基因，其产产物对维持细细胞的基本结结构和代谢功功能是必不可可少（forbasiccellularmetabolism），表达达水平受环境境因素影响较较小，在各生生长阶段的大大多数、或几几乎全部组织织中持续表达达，或变化很很小。表达只只受启动序列列或启动子与与RNA聚合合酶相互作用用的影响，而而不受其他机机制调节。如如微管蛋白基基因、糖酵解解酶系基因与与核糖体蛋白白基因等Housekeepinggenes:forbasiccellularmetabolism★每一个细胞都都会生产大量量的特殊的mRNAPoly(A)+RNA:eachcelltypeproducedifferentabundanceclassesofparticularmRNAs.一、CloningfrommRNAChapter6★cDNA:complementaryDNA(copyDNA),poly(A)+RNAastempleReversetranscriptase=RTaseOligo(dT)primerAlkalinehydrolysis(orRNaseH)toremovemRNAstrandT4DNApolymerase,klenowfragmentS1nucleasetoproduceablunt-ended一、CloningfrommRNAChapter6mRNAAAAAAA-3’5’Chapter6RTaseHO-TTTTTT-5’’AAAAAA-3’TTTTTT-3’TTTTTT-3’NaOHOHsscDNADNApolymeraseKlenowfragmentTTTTTT-3’S1nucleasedscDNASynthesisofcDNAmRNAAAAAAACCCC-3’’5’TTTTTT-5’’TTTTTT-5’AlkalinesucrosegradientdscDNAAAAAAA-3’5’TTTTTT-5’cDNA3’CTerminaltransferase+dCTP3’-CCCCCCRTaseTTTTTT-5’3’-CCCCCC5’-GGGGGGAddoligo(dG)primerChapter6Oligo（（dG）-primedsecond-strandcDNAsynthesisCCCC3’-C★blunt-endligation:S1nucleasedestroytheprotrudingendsofDNA;DNApolymerase(klenowfragment)fillingtheprotrudingendsofDNA.Maindisadvantage:1)isaninefficientprocess,requirehighconcentrationDNAforligation;2)vectorself-ligatetoproducecircularmoleculesortheinsert/vectorDNAsmayformconcatemersinsteadofbimolecularrecombinants,usephoshpatase(eitherBAPorCIP)topreventself-ligation;3)cloningsitedisappearintherecombinantDNA2CloningcDNAinplasmidvectorsTwomethods:1)Ligationofblunt-end2)Ligationofcohesivetermini

a.Useoflinkermoleculesb.HomopolymertailingCCGAATTCGGGGCTTAAGCCLinkers:areself-complementaryoligomersthatcontainarecognitionsequenceforaparticularrestrictionenzyme.DNAligaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCC5’-AATTCGGGCCCCGGGCTTAA-5’’EcoRI＋Adaptors:aresingle-strandednon-complementaryoligomersthatmaybeusedinconjunctionwithlinkers,whenannealedtogetherandbeaddedtothecDNAtoprovidesticky-endcloningwithoutdigestionofthelinkers.OH-GATCCCCGGGDNAligaseCCCGGGGGGCCCCTAG-OH-5’GGGCCCGGATCCCCTAGGBamHI+OH-GATCCCCGGGGGGCCC5’-OH-GATCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCHpaIIHomopolymertailing:theenzymeterminaltransferaseisusedtoaddhomopolymersofdA,dT,dGordCtoaDNAmolecule.PstIvectorCCCCCCCC-3’3’-CCCCCCCCInsertCTGCAGGGGGGGG-3’G3’-GGGGGGGGACGTCGPstIsiteGGGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGGGGACGT

TGCAGCCCCCCCCCCCCCCCCPstIsiteEnzymedigestionTerminaltransferase+dCPstIdigestionTerminaltransferase+dGDNAligaseTargetgene★Mainadvantage:1)packaginginvitromaygeneratetherecombinantphage,whichincreasestheefficiencyofthecloningprocess.2)mucheasiertostoreandhandlelargenumbersofphageclonesthanplasmids.3CloningcDNAinbacteriophagevectorsIfalargenumberofrecombinantswasrequired,andalow-abundancemRNAwastobecloned,phagevectorsmaybemoresuitable.CloningcDNAinλvectorsusinglinkers:EcoRImethylaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCAddEcoRIlinkersdscDNAMeMeCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCDigestwithEcoRILigateInsertvectorvectorLAλvectorRA★genomiclibrary:isoftenusedtodescribeasetofclonesrepresentingtheentiregenomeofanorganism.TodeterminetheintronsToexaminethecontrolsequencesresponsibleforregulatinggeneexpression二、CloningfromgenomicDNA1Genomiclibraries★aimofconstructingagenomiclibraryisforisolatingatargetDNAsequence.★Clonebank(library):Acollectionofindependentclonesistermedaclonebankorlibrary估计基因因组文库库大小的的经验（（empiricalformula））公式：：N=ln(1-P)/ln(1-a/b)N:thenumberofclonesrequiredP:desiredprobabilityofaparticularsequencebeingrepresented(0.95or0.99)a:theaveragesizeoftheDNAfragmenttobeclonedb:thesizeofthegenomeorganismGenomeSize(kb)No.clonesN,P=0.9520kbinserts45kbinsertsEscherichiacoli(bacteria)4.0×1036.0×1032.7×103Saccharomycescerevisiae(yeast)1.4×1042.1×1039.3×102Arabidopsisthaliana(simpleplant)7.0×1041.1×1044.7×103Drosophilamelanogaster(fruitfly)1.7×1052.5×1041.1×104Stroglyocentrotus

purpuratus(seaurchin)8.6×1051.3×1055.7×104Homosapiens(human)3.0×1064.5×1052.0×105Triticumaestivum(hexaploidwheat)1.7×1072.5×1061.1×106Geneticlibrarysizesforvariousorganisms选择哪种种载体用用于基因因组文库库构建？？Whichvectorisusedtochooseforconstructionofgeneticlibrary?λphagevector：：有效容容纳量是是15kbcosmidvector：有效效容纳量量是45kb建立基因因组文库库的一般般程序：：1．载体体DNA片段的的制备载体DNA分离离纯化限限制酶切切脱脱磷酸化化反应3.供供体与载载体DNA连接接提高重组组频率，，应注意意连接反反应体系系中总DNA浓浓度和两两种DNA分子的的摩尔数数比率。。2．供供体DNA片段段的制备备机械剪切切法总DNA分离纯纯化分分离特定定大小DNA片片段酶法（部分酶酶切、完完全酶切切）4.重重组DNA分子子的转移移和基因因组文库库的扩增增利用转化化或感染染方法将将连接好好的重组组DNA分子导导入宿主主细胞，，让其自自主复制制，重组组DNA分子被被扩增（（重组子子比率可可能发生生变化））。5.基基因组文文库质量量的评价价1）文库库规模----随机挑挑取一些些转化子子或重组组子，提提取质粒粒DNA，，电泳测测定插入入片段大大小，然然后根据据上述公公式计算算文库大小。。2）重组组频率----频率越越高，质质量越高高，可大大大减轻轻后续筛选基因因工作量量。CloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorCloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorThemolecularweightoftheDNAafterisolationfromtheorganism.ThemethodusedtofragmenttheDNA.文库的连连接、包包装和扩扩增TwomainconsiderationwhenpreparingDNAfragmentforcloning:Foracompletelyrandomlibrary,DNAmolecularweightshouldbeveryhigh.★100kbisavailable.★Fragmentationcanbeachievedeitherbymechanicalshearingorbypartialdigestionwitharestrictionenzyme.CTAGAnnealBamHISau3AGCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCGCCTAGGATCCTAGGATCCGCloningSau3AfragmentsintoBamHIsite5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEBSEBSEMBL4LeftarmRightarmSSLeftarmRightarmS/BS/BGATCCTAGGATCCTAGLigationofSau3A––cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL45’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEMBL4

GATCCTAGGATCCTAGEBSEBSLeftarmRightarmStufferfragmentSSLeftarmS/BGATCCTAGGATCCTAGS/BRightarmInsertDNASau3AcohesiveendSau3Acohesive

endLigationofSau3A-cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL4GATCCTAGGATCCTAGcoscosInsertInsertInsertcoscosLALALARARAPackagedinvitroConcatemericrecombinantDNAPrimarylibraryAmplificationoflibraryPlatingthepackagedphageonasuitablehostofE.coli,thenresuspendingtheplaquesbywashingtheplateswithabuffersolutionConcatemericrecombinantDNAandamplificationoflibrary4.更更先进的的克隆技技术Advancedcloningstrategies1)SynthesisandcloningofcDNAOkayama–Berg法法1）T引引物的合合成：在在质粒上上进行，，用于合合成第一一条cDNA链链2）G引引物的合合成：在在质粒上上进行，，用于合合成第二二条cDNA链链3）第一一条cDNA链链合成：：T引物物与mRNA退退火反反转录录反应4）第二二条cDNA链链的合成成：a.第一条cDNA链3’’-末端端加尾（（dCTP）b.限制酶切切除去载体上所所加的多多聚C尾尾巴c.与G引物物退火d.除去RNAe.合成第二二条cDNA链链5）cDNA文文库的形形成—转转化2)ExpressionofclonedDNAmoleculesPromoter（启启动子））:areregionswithaspecificbasesequence,towhichRNApolymerasewillbind.Strongpromoter:强启启动子Weakpromoter:弱弱启动子子Induciblepromoter:诱导导型启动动子在原核生生物中（（Inprokaryoticpromoter））：Consensussequence:Inprokaryoticpromoter,twomainregionsisimportant:-10region=Pribnowbox:5’-TATAAT-3’’-35region:5’TTGACA-3’真核生物物中（Ineukaryoticpromoter）:Enhancers（（增强子子）:maybelocatedhundredsorthousandsofbase-pairsupstreamfromtheTcstartsite.-25position：：CAATbox.Around-25positionwiththeconsensussequence5’-TATAAAT-3’(theTATAorHognessbox)andasequenceinthe-75regionwiththeconsensus5’-GG(T/C)CAATCT-3’,knownastheCAATbox.EcoRISacIPstIHindIII1）SacI2）TdT+dTTPEcoRISacITTTTTHindIIITTTTTAAAAAmRNAAMV-RT+dNTPTTTTTTTTTTAAAAATdT+dCTPTTTTTAAAAATTTTTCCCCEcoRISacIPstIHindIIICCCC1）HindIII2）取大片片段TTTTTCCCCSacIHindIIIPstI1)PstI2)TdT+dGTPEcoRIGGGGHindIIIGGGGPstISacI1）HindIII2）取小片片段HindIIIGGGGBAC:bacterialartificialchromosomesYAC:yeastartificialchromosomesCloninglargeDNAfragmentsinBACandYACTELTELtrp/ARS/CENYACuraCloninginaYACvectorHighmolecularweightgenomicDNAPartialdigestUpto500kb1.两臂臂DNA片片段的制备备:pYAC4BamHI/EcoRI脱脱磷酸化化2.供体体DNA片片段的制备备:琼脂糖凝胶胶-DNA样品的制制备EcoRI部分酶酶切脉脉冲场场凝胶电泳泳片片段回收收和纯化3.DNA的连连接4.重组组DAN分分子的转化化:原生质体转转化法5.转化化子的保存存:单菌落保存存于96孔孔平板中利用YAC载体构建建基因组文文库酵母人工染染色体构建建（4）SMART(SwitchMechanismAtthe5’endofRNATemplates)1)当反反转录酶合合成到mRNA模板板5’端后后，它会在在第一链的的3’端加加上几个C；2)合成成的寡核苷苷酸G与C配对；3)反转转录酶以新新合成的cDNA为为模板，继继续合成第第二条cDNA链；；4)LDPCR—LongDistancePCR1.基因因特异性常来自结构构基因，因因此仅代表表某种生物物的一小部部分遗传信信息，且只只代表那些些正在表达达的基因的的遗传信息息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA2.器官官特异性不同器官或或组织的功功能不一样样，因而有有的结构基基因的表达达就具有器器官特异性性，故由不不同器官提提取的mRNA所组组建的cDNA文库库也就不同同cDNA文文库的特点点4.不均均匀性在同一个cDNA文文库中，不不同类型的的cDNA分子的数数目是大不不相同的，，尽管它们们都是由单单拷贝基因因转录而来来的。这与与基因组文文库中的单单拷贝基因因均具有相相同的克隆隆数相较，，这是两种种文库的另另一差别。。5.各各cDNA均可获得得表达（一一般选用的的载体都是是表达型的的）3.代谢谢或发育特特异性处于不同代代谢阶段（（或发育阶阶段）的结结构基因表表达亦不相相同1.限制性核酸酸内切酶三三种类型的的特点？为为什么基因因工程中需需选II型酶。2.TypeIIrestrictionendonucleases的命名原则则。（EcoRI）3.酶活性单位位定义？4.Bal31、ExoIII、DNaseI，酶的作用用特点。5.反转录酶。。6.BAP和CIP分别指什么么酶，作用用特点是什什么？。7.DNALigase的特点。8.DNApolymerase与DNALigase的异同点？？思考题：9.AfragmentofmouseDNAwithEcoRIstickyendscarriesthegeneM.ThisDNA,whichis8kblong,isinsertedintothebacterialplasmidpBR322attheEcoRIsite.therecombinantplasmidiscleavedwithtwodifferentrestrictionenzyme.Thesizefragmentsthatwereobtainedonanagrosegelareistedbelow.Drawtherestrictionmapforthissequence.EcoRIBamHIEcoRI+BamHI2.5kb1.0kb思考题：TheEndThankYou!9、静夜夜四无无邻，，荒居居旧业业贫。。。12月月-2212月月-22Saturday,December24,202210、雨中中黄叶叶树，，灯下下白头头人。。。09:57:1709:57:1709:5712/24/20229:57:17AM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2209:57:1709:57Dec-2224-Dec-2212、故人江海海别，几度度隔山川。。。09:57:1709:57:1709:57Saturday,Decembe