急性脑梗死患者中性粒细胞活化的研究

急性脑梗死患者中性粒细胞活化的研究【内容摘要】目的讨论中性粒细胞活化在急性脑梗死疾病患者中的意义。方法抽取急性血栓构成性脑梗死患者及健康志愿者外周血，运用流式细胞技术检测中性粒细胞外表黏附分子cd62l和cd11b/cd18表达。运用放射免疫分析检测血浆il6、il8、tnfα水平，用酶联免疫吸附试验检测血浆il10水平。结果相对于正常组，脑梗死组中性粒细胞cd11b/cd18平均阳性表达率显著升高(p0.001)；cd62l平均阳性表达率明显降低；细胞因子水平均明显升高(p0.001)。结论在急性血栓构成性脑梗死的急性期，中性粒细胞处于活化状况。以细胞黏附为表现的中性粒细胞活化加快了血栓的进程，可能是血栓构成的主要发病原因之一。【本文关键词语】急性血栓构成性脑梗死；中性粒细胞活化；细胞黏附；细胞因子significanceofneutrophilactivationonpolymorphonuclearneutrophilinpatientswithacutecerebralinfarctionyuanping,zhoujing,zhouxiangyu.(theaffiliatedhospital,luzhoumedicalcollege,luzhou,646000,china)abstract:objectivetostudythesignificanceofpolymorphonuclearneutrophilactivationinpatientswithacutecerebralsfortynevertreatedcerebralinfarction(ci)subjectshavebeenselectedtothestudy,thirtyhealthysubjectswerestudiedascontrolgroups.expressionofcd62landcd11b/cd18onpmnwereanalyzedbyflowcytometry(fcm).radioimmunoassay(ria)wereusedtodetectplasmalevelofil6,il8,andtnfα,enzymelinkedimmunosorbentassay(elisa)wereusedtomeasureplasmalevelofilstheaveragepositiveexpressionpercentageofcd11b/cd18ofneutrophilfromthepatientswithacuteciishigherthanthecontrolgroup(p0.01),andtheaveragepositiveexpressionpercentageofcd62lislowerthanthecontrolgroup(p0.01).thelevelsofplasmacytokinesinthecigroupswereincreasedmarkedlycomparedwithnormalcontrol(p0.001).conclusionexpressionofcd11b/cd18andcd62landlevelofplasmacytokinesmightberegardedasthemarkerofpmnactivation,pmnactivationplaysanimportantroleinacutecibyexpeditetheprogressofthrombosis,increasetheinflammationaroundthrombusanddegreeofinjuredbloodvessel.keywords:acutecerebralinfarcton;polymorphonuclearneutrophilactivation；adhesionmolecule;cytokine随着对血栓及炎症研究的深切进入，中性粒细胞〔polymorphonuclearneutrophil,pmn〕活化及其外表黏附分子表达异常在急性脑梗死〔cerebralinfarction,ci〕的发生、发展中的主要作用日益遭到看重[1]。为此，本实验试图通过检测外周血中性粒细胞cd62l和cd11b/cd18的表达以及细胞因子水平，讨论pmn活化在这里类疾病中的作用。1资料与方法1.1研究对象选择2006年3月至2006年7月在泸州医学院附属医院神经住院的急性脑梗死患者40例，其中男19例，女21例，年龄35~59岁，平均47.2±8.4岁。入选标准：发病72h以内，符合第四届全国脑血管病会议制订的诊断标准的ci患者，并经ct或mri证明,排除栓塞性ci、腔隙性ci及其它病因ci；排除妊娠、感染、肿瘤、先天性抗凝因子缺陷或血管异常者。正常健康志愿者30例，男16例，女14例，年龄18~53岁，平均45.3±4.6岁。均系无心、肝、脑、肾和感染性疾病及糖尿病的健康成年人。两组年龄及性别无统计学差别〔p0.05〕。1.2cd11b/cd18和cd62l的检测1.2.1标本收集病例组及正常对照组清晨空腹经肘静脉采血2ml〔1∶9肝素抗凝〕，悄悄混匀，6h内行流式细胞仪测定。1.2.2标本预备采取双染色法，分别取实验组及对照组血标本100μl参加20μl藻红蛋白〔pe〕标记鼠抗人cd11b单克隆抗体〔pecd11b，美国beckmancoulter公司〕与异硫氰酸标记〔fitc〕标记鼠抗人cd62l单克隆抗体〔fitccd62l，美国beckmancoulter公司〕，避光静置，室温孵育20min。先后参加immunoprepa液〔美国beckmancoulter公司配方〕650μl毁坏红细胞膜，以及immunoprepb液265μl〔美国beckmancoulter公司配方〕保卫白细胞膜，振荡均匀后流式细胞仪上机检测。每份样本均以大鼠抗小鼠peigg1及fitcigg1〔美国beckmancoulter公司〕为阴性对照。1.2.3流式细胞仪检测美国beckmancoulter公司epicsxl型流式细胞仪，利用cellquest流式细胞图象数据分析软件，分析设定计数到达1×105次“事件〞(events)后，检测中性粒细胞cd11b/cd18及cd62l表达，然后用中性粒细胞对抗体的阳性表达率来表示实验结果。见图1。1.3细胞因子的检测1.3.1标本的收集与制备于清晨空腹采静脉血3ml，其中dvt组均为发病7d以内，置未加抗凝剂的干净生化管中，以离心半径8cm,3000r/min离心20min分离血清，分别按1次用量分装，置-40℃冰箱保存备用。1.3.2检测方法运用ria法检测血浆il6、il8、tnfα水平，相应的放免试剂盒由中国人民当兵的人总医院科技开发中心放免所提供；用elisa法检测血浆il10水平，人il10elisa试剂盒由美国rd公司提供。方法均根据试剂盒操作步骤进行。1.4数据统计各组数据以均数±标准差表示。两组间比较采取t检验。相关分析采取pearson相关分析(双尾法)。所有统计学处理均由spss11.4软件包完成。2结果2.1两组外周血pmn外表cd62l的表达脑梗死组外周血cd62l的平均抗体阳性表达率〔61.058±8.925〕%明显低于正常组(73.316±1.276)%,差别具有统计学意义。(p0.001〕。见表1、图2、图3。2.2两组外周血pmn外表cd11b/cd18的表达脑梗死组外周血cd11b/cd18的平均抗体阳性表达率(55.598±10.356)%，显著高于正常组(20.031±0.540)%差别有显著性(p0.001〕。见表1、图2、图3。2.3两组细胞因子水平比较结果静脉血栓组il6、il8、il10、tnfα水平均显著升高，与正常对照组相比差别有统计学意义〔p均0.001〕。见表2。表1ci组与对照组cd62l、cd11b/cd18阳性表达率比较表22组血浆il6、il8、il10、tnfα水平比较两组比较p0.0013讨论随着对ci研究的深切进入，越来越多的研究结果表示清楚，炎症反应在ci中具有主要的意义，而pmn活化在炎症经过中的作用日益遭到看重。haceberg等[2]通过体外研究动脉血栓模型以及临床血栓疾病，证明在狭窄动脉的血管腔内，有pmn大量地聚集，而且与血栓的进展和血小板的活化有关。而esposito等[3]研究血管手术移植物血栓发现，pmn活化，黏附分子表达水平显著变化。在ci和炎症经过中，pmn通过细胞外表的黏附分子与血管内皮发生黏附，导致中性粒细胞在微血管中积滞，并释放溶酶体酶、组胺、白三烯等活性物质，以及il6、il10、tnf等细胞因子，损伤内皮细胞及血管壁，促进血管收缩及血小板黏附、聚集，导致血栓构成。同时，缺血性脑梗死患者黏附分子升高促使白细胞黏附于血管内皮，构成小栓子，壅塞微循环，引起组织缺血和损伤；随后，黏附于血管内皮细胞外表的白细胞与浸润于脑组织的白细胞互相激活后，产生和释放氧自在基、血管活性物质等，导致血管进一步损伤，加剧了缺血缺氧的经过。黏附分子中的选择素〔selectin〕介导了最初的黏附，在滚动和结实黏附经过中，伴随细胞因子的释放和表达，整合素〔integrin〕起主要的作用，引起pmn的进一步活化。在这些黏附经过中，以l选择素〔lselectin，cd62l〕和整合素αmβ2〔cd11b/cd18，mac1〕及其相应的配体所起的作用较大[3,5]。文献已证明cd62l和cd11b/cd18能够作为pmn活化时的特征性标记物[6]。在血栓构成经过中，通过cd11b/cd18传递跨膜信息，能够诱导中性粒细胞产生il6,il8,il10,tnf等细胞因子；而血栓炎症部分的巨噬细胞、血液中的单核细胞和中性粒细胞合成的细胞因子等炎症介质，又能够迅速上调黏附分子的表达，导致内皮细胞、白细胞、血小板进入活化状况的作用[7]。关于pmn活化在ci发病中的研究不多，结果也不一致，且国内还未见系统的报道黏附分子cd62l和cd11b/cd18表达的情况。我们运用fcm检测pmn外表黏附分子表达，减少了体外分离pmn诱导黏附分子表达异常所造成的人工假象。结果发如今ci患者外周血中，与健康对照组相比，存在pmn外表黏附分子cd62l表达的下调和cd11b/cd18表达的上调，这就说明在ci中pmn是处于活化状况的，pmn活化时l选择素和β2整合素表达的异常以及二者之间互相影响在动脉血栓疾病中起主要的作用。血栓构成、炎症反应都离不开细胞与细胞间信息传递与互相作用。而这种互相作用处径之一是通过可溶性介质，即细胞因子和其他化学介质。研究证明[8]，炎性细胞因子il6、il8、il10、tnfα在动脉血栓构成中发挥主要的作用。其中il6、il8、tnfα起致炎症作用，而il10起抗炎症作用，可能是主要的保卫性抗炎因子。本研究结果显示，在急性ci患者外周血中炎性细胞因子il6、il8、il10、tnfα水平是显著升高的，说明无论致炎因子还是抗炎因子，在ci疾病的发病经过中均发挥主要的作用。炎症时，炎性细胞释放细胞因子il6、il8、tnfα等炎症介质，促进炎性细胞与血管内皮间的黏附，加快了炎症的进程，以及血栓四周炎症水平和血管壁的损伤。而同时释放的抗炎因子il10等则通过降低黏附分子的表达，抑制白细胞的外渗而发挥抗炎作用。通过对动脉血栓的研究发现[6]，当用il6、tnfα干涉后，cd11b/cd18抗原表达明显升高，同时il6降低细胞黏附分子l选择素〔cd62l〕的水平，其机制可能通过直接降低pmn上cd62l的转录与翻译起作用。也有研究[7]以为tnfα与白细胞作用能够引起cd11b/cd18表达的增长和cd62l的脱落，其生物学效应可能经nfκb通过受体介导途径来实现。狄政莉[9]等研究鼠缺血再灌注模型发现il8再脑缺血再灌注时水平急剧上升，表示清楚il8可能对中性粒细胞与内皮细胞的黏附及进入损伤区起趋化作用。frenkel等[10]研究证明，il10通过抑制th1细胞，进而阻拦th1型炎症反应，减轻脑卒中引起的损伤。本实验证明，在ci的急性期，pmn活化可能起主要的作用。细胞黏附分子介导了pmn、血管内皮细胞、血小板之间互相聚集与黏附，这一经过贯穿了血栓构成的发生、发展经过。观察细胞黏附分子cd62l和cd11b/cd18表达以及炎症细胞因子水平，对临床ci疾病早期监测、判定病程和判定预后有主要意义。本实验也为进一步开展抗pmn活化治疗提供了理论根据。【以下为参考文献】［1］sorianosg,coxona,wangyf,etal.micedeficentinmac1(cd11b/cd18)arelesssusceptibletocerebralischemia/reperfusioninjury［j］.stroke,1999，30(1):134139.［2］hagbergia,roaldhe,lybergt.adhesionofleukocytestogrowingarterialthrombi［j］.thrombhaemost,1998，80(5):852858.［3］espositocj,popescuwm,rinderhm,etal.increasedleukocyteplateletadhesioninpatientswithgraftocclusionafterperipheralvascularsurgery［j］.thrombhaemost,2003,90(6):11281134.［4］tul,poejc,kadonot,etal.afunctionalroleforcirculatingmouselselectininregulatingleukocyte/endothelialcellinteractionsinvivo［j］.jimmunol,2002,169(4):20342043.［5］coatag,pennacchil,biniv,etal.solubleadhesionmolecules:markerofpreeclampsiaandintrauterinegrowthrestriction[j].jmaternfetalneonatalmed,2002,12(1):2834.［6］suwat,hoggjc,quinlankb,etal.theeffectofinterleukin6onlselectionlevelsonpolymorpho