原料纯化工艺课件

原料纯化工艺培训原料纯化部简介原料纯化部由单抗、多抗、基因、合成4组组成其产品主要涉及DOA系列、HCG、ID系列等单克隆抗体基本概念制备流程纯化方法检验方法制备难点制备流程纯化方法盐析（1020007301制备）凝胶过滤离子交换层析（1020002801制备）

辛酸沉淀法（1020000201制备）

原理

用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。硫酸铵是最常用的中性盐特点成本低，步骤简单。抗体的回收率比较高。抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带,不适合于做各种标记。

工作示意图特点成本高，步骤较简单。抗体回收率较高，分离条件缓和，抗体活性不受影响。抗体纯度较高

原理利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离工作示意图步骤硫酸铵沉淀抗体，粗提；样品过柱；洗去没有结合的物质；用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液；紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品；汇集样品，浓缩，测定浓度

特点成本较低，步骤较简单。抗体回收率较高。抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要冷柜，自动收集器。

步骤调节样品pH值,加入正辛酸,搅拌30min室温高速离心,收集上清液；再加入硫酸铵（40%饱和度）；4℃高速离心,弃上清；溶解沉淀，透析，测定浓度

特点成本较低，步骤较复杂。抗体回收率很低。抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种标记

检验方法Elisa:亲合力、特异性蛋白印迹试验WB(WestBlotting):抗体特异性、相应蛋白质抗原分析免疫组化：抗体特异性、相应抗原表位定位HPLC：样品组分分析、纯度鉴定制备难点

细胞株的构建及筛选：生物阶段的不确定性。纯化抗体的有效检控指标概念多克隆抗体（polyclonalantibody）针对多种抗原决定簇的混合抗体，简称多抗制备流程基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完 全佐剂加强免疫：抗原量减半，多次，间隔2-4 周，用佛式不完全佐剂测效价：加强免疫两次或三次以后的第 7天取血，测效价制备血清：最后一次免疫后7-10天放血， 离心取血清（多抗）亲和层析法原理将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体步骤(1028004003制备)将ProteinA与活化的柱子相结合将腹水或血清处理后过柱用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品汇集样品，浓缩，测定浓度

特点成本高，步骤较简单抗体回收率低抗体纯度高，适合于各种标记纯化后抗体体积大，需要浓缩

多抗特点

比单抗更容易捕捉抗原多抗特异性一般比单抗差，更易有交叉反应抗体的纯化、标记比单抗难基因

基本概念制备流程纯化方法常用测定方法概念基因体外重组即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。受体细胞通过转化直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状。基因上游流程图纯化流程菌体蛋白可溶蛋白不可溶蛋白超声破碎洗IB，裂解细胞裂解液过柱纯化洗脱有活性蛋白无活性蛋白样品收集样品收集(稀释、透析)(复性)

备注包涵体存在于大肠杆菌细胞质中，采用的生物学技术导入的外源基因，在细菌中获得外源蛋白的高效表达，造成相当多的蛋白质产物在细菌内凝集为没有活性的固体颗粒。可溶性的蛋白质最终会分泌到周质空间，或分泌到培养液中。超声机理：强声波作用溶液时，气泡产生，长大，和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎纯化方法大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）常用测定方法280nm光吸收法Bradford检测法Lowry法280nm光吸收法原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比优点：快速，对蛋白无破坏缺点：不是严格定量，此法是根据酪氨酸，苯丙氨酸，和色氨酸残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白有不同的消光系数；核酸有强干扰作用Bradford检测法原理：考马氏亮兰G-250，这种染料具有负电荷，可以与蛋白质分子上的正电荷结合后，产生兰色化合物，反应化合物在465-595nm有最大光吸收值。优点：快速，灵敏度高，干扰物质少缺点：对各种纯化蛋白反应不同；对蛋白质引起不可逆的反应Lowry法原理：又称Folin-酚试剂法。首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸，产生钼蓝-钨蓝复合物的深兰色，反应化合物在655nm有最大光吸收值。优点：一种可靠的蛋白质定量方法。缺点：干扰物质多，有些试剂不稳定，蛋白不可逆变性合成抗原基本概念半抗原与载体的连接影响因素常用测定方法基本概念半抗原是指本身无免疫原性，只具有反应原性的物质半抗原不能直接用作免疫原，只有把这些半抗原和大分子物质结合后，才具有免疫原性。这种经过人工修饰的半抗原称之为人工抗原半抗原与载体载体用于偶联半抗原的大分子物质称为载体常用的载体蛋白质类多肽聚合物大分子聚合物蛋白质类蛋白质是一类结构复杂的胶体两性化合物，是一种常用的良好载体。常用为载体的免疫原性蛋白质有牛血清蛋白（BSA）、牛血清丙种球蛋白（BGG）、钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）等半抗原与载体的连接物理方法：借电荷、微孔吸附半抗原化学方法：含有-COOH、-NH2或-SH

不含-COOH、-NH2或-SH含有-COOH、-NH2或-SH利用偶联剂通过功能基团（-COOH、-NH2或-SH等）直接把半抗原连接到载体上偶联方法碳二亚胺法

活泼酯法

重氮化法戊二醛法混和酸酐法过碘酸氧化法等等碳二亚胺法碳化二亚胺含有N=C=N结构的官能团，是一种化学性质非常活跃的双功能试剂DCCDCC(N,N‘-dicyclohexylcarbodiimide）DCC特点反应可以在多数溶剂中进行，反应速度较快，而且可以通过适当的控制方法，抑制副反应的发生。价格相对较便宜副产物N,N'-二环己基脲(DCU)混在连接产物中而很难完全除尽，不能得到高纯度的产品

EDCEDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)EDC特点EDC是水溶性的，因此其介导的缩合反应可以在水溶液中进行，不需要加入有机溶剂。使用高纯度的、结晶EDC可以获得高纯度的活性中间体

中间体在水溶液中不稳定，并易于水解由于碳二亚胺的缩合反应没有选择性；易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物活泼酯法含有羧基的半抗原碳二亚胺的作用下，与N—羟基琥珀酰亚胺反应，生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶联物特点本法是对碳二亚胺法的改进：由于避免了碳二亚胺对蛋白的直接作用，从而避免了蛋白分子间的交联。EDC介导的缩合反应在NHS的存在下，效率大大提高属于一种中性连接，过量的试剂及缩合副产物可以很容易地用水或稀酸洗去。不含-COOH、-NH2或-SH半抗原经过改造后，引入功能基团再用上述方法进行连接以1020001702制备为例（琥珀酸酐法）琥珀酸酐法本法用于带有羟基的半抗原的改造将带有羟基的半抗原和琥珀酸酐反应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物将吗啡与BSA蛋白质连接。因吗啡结构中只有-OH而无-NH2及-C