大肠杆菌感受态细胞的制备和转化课件

实验九，十

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，称感受态细胞。一.实验原理1.概念感受态细胞

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化RbCl(KCl)法，CaCl2法，电击感受态制备等

RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪

CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.常用的感受态细胞制备方法CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于0～4℃，CaCl2

低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr

）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

CaCl2

法制备感受态细胞原理提高转化效率的几个因素

细胞生长状态和密度质粒的质量和浓度试剂的质量防止杂菌和杂DNA的污染

细胞生长状态和密度:

不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600

来控制。DH5α菌株的OD600

为0.5时,细胞密度在5×107

个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。提高转化效率的几个因素

试剂的质量:

所用的试剂,如CaCl2

等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处

防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

提高转化效率的几个因素0.1mol/L的CaCl2LB液体培养基

LB固体培养基

Amp母液：氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成100mg/ml水溶液,-20℃保存备用

3.试剂受体菌的培养

1)从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃,180rpm振荡培养过夜；

2)将该菌悬液以1:30-100的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2－3小时至OD600在0.3-0.4左右;3)无菌条件下取1.5ml菌液到eppendorf管中，冰浴10min，4℃,8000rpm离心5min;4)彻底弃上清液，在冰浴上加入500ul预冷的无菌CaCl2(0.lmol/L)使细胞悬浮；

5)4℃,8000rpm离心4min，弃上清液(4,5步可重复1-2次）;6)用100μl预冷的无菌CaC12(0.lmol/L)重新悬浮细胞，冰上备用；注：如果需要保存，用80ul预冷的无菌CaC12(O.lmol/L)和20ul无菌的70%甘油悬浮细胞，液氮冷激10min后，-70℃以下保存备用。2.转化

取100μl感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入10μl连接产物（或质粒DNA）(含量不超过50ng,体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上30-40min；A.质粒DNA组：10µlpBS质粒DNA+100µl感受态细胞悬液B.空白对照组:10ul无菌水＋100µl感受态细胞悬液

42℃水浴中热击90秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却2min；向管中加入400μLLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃，180rpm振荡培养40min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)；涂平板：将上述菌液摇匀后取100ul涂布于含Amp的筛选平板上，在菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养皿培养12~16h。

注意：1、含Amp的LB固体培养基的配制:将灭菌的LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后倒平