基因克隆载体课件

基因克隆载体一、概念克隆载体是一种能够携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其在受体细胞得以维持或表达的DNA分子。载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件二、基因克隆载体必须具备的条件1、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。2、能携带外源DNA片段进入受体细胞自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。3、自身分子质量较小，拷贝数高。4、必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。5、安全性。不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞。第一阶段以质粒、λ噬菌体、柯斯质粒为主,主要特点是载体在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高,但是克隆容量有限,一般小于45kb。第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量,显著特点是载体的容载能力扩大,约100～350kb,主要有酵母人工染色体、细菌人工染色体、以及源于噬菌体P1的人工染色体。第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元细菌人工染色体(BIBAC)和可转化人工染色体(TAC),这些载体不仅具有较大的克隆容量,而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。四、常用克隆载体质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体大片段双元载体1、质粒载体（1）

生物学特征:质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。目前对大肠杆菌的质粒研究得比较深入。质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒1-3拷贝松弛型质粒10-60拷贝（2）质粒的不亲和性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中。亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒。不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒意义：受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒。（4）迁移作用某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，发生DNA转移的过程。（5）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。（7）重要的大肠杆菌质粒载体：pBR322质粒载体：（1）较小的分子量，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA。（2）带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。（3）较高的拷贝数，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。（4）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。2、噬菌体载体（1）定义噬菌体是病毒的一种，其DNA能被开发成为基因工程的有用载体，高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞，自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。噬菌体主主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有双链的λ类噬菌体和单链的M13噬菌体。（2）噬菌体的生长周期：溶菌周期、溶源周期溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。在溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。只有溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。（3）噬菌体生物学特征DNA为线状双链DNA分子，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点。噬菌体构建的基本策略:切去部分非必需区删掉多余的限制性内切酶位点插入选择性标记基因建立体外包装系统噬菌体DNA作为载体的优点：DNA在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌DNA载体的装载能力为25kb，远大于质粒的装载量重组DNA分子的筛选较为方便重组DNA分子的提取较为简便DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因λ噬菌体克隆载体的应用

建立cDNA基因文库：转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。效率高。转染(transfection)指真核细胞主动或者被动导入外源DNA片段而获得新表型的过程。克隆外源目的基因噬菌粒载体：针对M13噬菌体的局限性发展的一类由质粒载体和单链噬菌体结合而成的新型载体--噬菌粒。常用噬菌粒载体有pUCll8和pUCll9噬菌粒载体是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成的噬菌粒载体。噬菌粒载体的特点：能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA重组操作简便，筛选容易3、柯斯质粒载体（1）定义：柯斯质粒是一类人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分组成：A.多克隆位点区B.含有cos位点的DNA区C.复制起始位点和抗性标记区（3）柯斯克隆：应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmidcloning）。这种技术的理论依据是，在线性λ噬菌体DNΑ分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位点）。在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系，叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。只有在被作用的λDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在38～54kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。4、人工构建载体（1）定义：将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）P1派生人工染色体（PAC）哺乳动物人工染色体（MAC）人类游离人工染色体（HAEC）（2）人工染色体的制备原理：天然染色体基本功能单位包括复制起始点、着丝粒和端粒(telomere)。复制起始点，保证了染色体复制，着丝粒保证了染色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。人们为了克隆大片段DNA，利用DNA体外重组技术分离了天然染色体的基本功能元件并将它们连接起来，从而构成了人工染色体。相比于其他复制子而言，染色体要大得多。（4）酵母人造染色体（YAC）酵母人工染色体（YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，可以插入人工染色体100-2000kb的外源DNA片段。YAC是有酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。酵母人造染色体（YAC）优点：可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。酵母人造染色体（YAC）缺点：克隆外源基因易出现嵌合体。有些克隆不稳定。YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。应用领域：在染色体区带构建YAC重叠群，可以促进大规模基因组测序和致病基因的克隆。

BAC优点:以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建BAC文库比YAC文库更容易;BAC载体以环型超螺旋状态存在,从大肠杆菌中提取质粒较方便,而从酵母中分离DNA较困难;BAC的复制子来源于F因子,可稳定遗传,嵌合及重组现象少;可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因,方便快捷;BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子,可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序。YAC、BAC载体不能直接进行植物转化,在候选克隆的转化互补实验中需要将外源片段进行亚克隆,因而工作量大,同时也有漏失目的DNA片段的可能。因此,可直接用于植物转化的大片段双元载体便应运而生,具有代表性的载体系统有BIBAC和TAC。5、大片段双元载体（1）双元细菌人工染色体(BIBAC)结合BAC载体和Ti质粒的特点,构建了双元BAC载体BIBAC2,该载体在结构上具有BAC的复制系统,又加入在农杆菌中起作用的Ri复制子和抗卡那霉素筛选标记及T2DNA的左右边界,因此BIBAC能在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭复制。（2）P1克隆系统和源于P1的人工染色体(PAC)PAC载体以F因子和噬菌体P1为基础构建,兼有二者的特点,通过电激穿孔转化可将PAC导入大肠杆菌。其特点是插入的外源DNA没有明显的嵌合和缺失现象,PAC载体可以插入约300kb的外源片段,可以稳定遗传及高效扩增。PAC载体在基因分离和序列分析当中,可作为YAC连续克隆群的重要补充,日本水稻基因组计划(RGP)已把水稻的PAC文库用于物理图谱的构建。（3）可转化人工染色体(TAC)结合BIBAC和PAC载体的特点,构建了TAC载体,TAC载体具有P1复制子和Ri质粒复制子,能在大肠杆菌和农杆菌中穿梭复制。TAC载体具有以下优越性:与BIBAC载体一样具有克隆大片段DNA和借助于农杆菌直接转化植物的功能。具有大肠杆菌和农杆菌的复制子,是一个穿梭质粒,在大肠杆菌和农杆菌中均保持稳定。可通过农杆菌介导直接进行基因功能互补实验。（4）多基因转化载体系统基于生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应,受多基因或基因簇的控制。研究者们对发展多基因转化系统,将多个基因导入到植物进行