2021荧光分光光度法推荐资料

第六章荧光(yíngguāng)分光光度法第一页，共21页。基本(jīběn)要求：了解荧光光谱法的基本(jīběn)原理和应用特点。了解荧光分光光度计的组成以及特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。了解影响荧光强度的因素。第二页，共21页。第一节概论(gàilùn)回顾(huígù)：四大(sìdà)类电化学分析法光学分析法色谱分析法其它分析方法原子光谱法分子光谱法X射线光谱法核磁波谱法紫外-可见光分光光度法荧光分光光度法红外吸收光谱法拉曼光谱法第三页，共21页。一、应用(yìngyòng)：1.定量分析能产生荧光或能形成荧光配合物的物质(wùzhì)。2.简单定性回答“是不是”。二、特点(tèdiǎn)：灵敏度高，比吸收光谱法高10³~104倍。ppb选择性比吸收光谱法好。第四页，共21页。第二节

基本原理

一、分子荧光的产生物质(wùzhì)吸收光辐射价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。荧光磷光无辐射跃迁激发态亚稳态（三重态）基态第五页，共21页。最常见的光致发光：荧光和磷光(línɡuānɡ)。两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～10-6秒，磷光(línɡuānɡ)寿命10-3～10秒。荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。第六页，共21页。二、激发光谱和发射光谱(fāshèɡuānɡpǔ)⒈激发光谱固定(gùdìng)荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。300350400λ(nm)

F【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。第七页，共21页。⒉发射光谱固定(gùdìng)激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。300350400λ(nm)

F【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。第八页，共21页。三、分子荧光与分子结构(fēnzǐjiéɡòu)的关系分子要产生(chǎnshēng)荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。能产生荧光(yíngguāng)的分子具有的结构特点：共轭双键刚性平面多环结构

【例】芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。第九页，共21页。四、荧光(yíngguāng)强度与浓度的关系Φ：量子效率，发射光量子与吸收(xīshōu)光量子之比。I0：入射光强度ε：摩尔吸光系数b：光程c：浓度0εbc公式成立前提条件：即：当试样浓度较低时（），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子(fēnzǐ)碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。）第十页，共21页。Φ：量子效率，发射光量子与吸收(xīshōu)光量子之比。能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测(jiǎncè)器。⑵测出相应的荧光强度F1F2F3F4F5物质(wùzhì)吸收光辐射价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态释放能量⒈以热能的形式。回顾(huígù)：第一节概论(gàilùn)一、应用(yìngyòng)：由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。特点：1．光源方向与检测(jiǎncè)方向成直角；一、基本(jīběn)结构示意图1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。选择性好，与能产生(chǎnshēng)荧光的物质少有关。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当(shìdàng)范围内。简单定性回答“是不是”。第三节荧光(yíngguāng)分光光度计一、基本(jīběn)结构示意图特点：1．光源方向与检测(jiǎncè)方向成直角；2．二个单色器。·显示器检测器荧光单色器样品池激发光单色器光源第十一页，共21页。二、主要部件(bùjiàn)及功能1．光源高压汞蒸气(zhēnɡqì)灯，氙灯。能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。2．激发光单色器作用：提供单波长的激发光。色散元件：棱镜或光栅。出射狭缝宽度可调。第十二页，共21页。3．样品池须用石英材料制成。4．荧光单色器将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧光通过。出射狭缝宽度可调。5．检测(jiǎncè)器光电转换元件，测定荧光的强度。检测(jiǎncè)方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测(jiǎncè)器。第十三页，共21页。第四节定量分析(dìngliàngfēnxī)一、定量方法一般采用工作(gōngzuò)直线法。作C—F直线。FC第十四页，共21页。⑴配制一系列待测成分(chéngfèn)的标准溶液C1C2C3C4C5⑵测出相应的荧光强度F1F2F3F4F5⑶建立工作直线（F→C）①作图法②回归法⑷测量待测样品，得F样①从工作直线上找到待测成分(chéngfèn)的浓度C样②由回归方程计算出C样第十五页，共21页。二、影响荧光强度测定(cèdìng)的因素1．激发光照射有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解(fēnjiě)而导致F↓。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。2．温度温度↑，荧光效率下降，F↓。（因为，温度↑，增加分子间碰撞机会而使能量消耗掉。）第十六页，共21页。4．溶剂有些溶剂会使荧光(yíngguāng)效率下降，也可能带来干扰荧光(yíngguāng)。

苯胺pH7～12时，发兰色荧光。pH﹤2或PH﹥13时，无荧光。【例】所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当(shìdàng)范围内。3．pH值pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而(cóngér)影响荧光强度。第十七页，共21页。灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。选择性好，与能产生(chǎnshēng)荧光的物质少有关。三、定量分析(dìngliàngfēnxī)的特点及应用第十八页，共21页。思考题一、概念（荧光(yíngguāng)）激发光谱（荧光(yíngguāng)）发射光谱第十九页，共21页。二、问答题试述分子荧光产生的过程。试述分子荧光强度与浓度(nóngdù)的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路