细胞生物学03课件

1、细胞生物学主讲：黄小云第三章 细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节 细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术（light microscopy） 电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 第二节 细胞组分的分析方法 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 细胞的培养 细胞工程 二、 电

2、子显微镜技术 电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） SPM(Scanning probe microscope)三、 扫描遂道显微镜Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显

3、示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。（4）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）原理与应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特

4、异蛋白质 等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）原理应用：排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.41.7)， 可重构样品的三维结构。相差显微镜（phase-contrast microscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技

5、术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造扫描电镜原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题一、 离心分离技术 用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深

6、浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining三、特异蛋白抗原的定位与定性 免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图） 蛋白电泳(SDS) 与免疫印迹反应(Western-Blot) 免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等四、细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） 电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） PCR技术 五、放射自显影技术原理及应用：利用

7、同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 放射自显影一、细胞的培养 动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失植物细胞培养 类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系（cell-free system） 二、细胞工程 细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术单克隆抗体（monoclone antibody）技术 图细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术(图1、图2)化学法结合离心技术制