光谱基础课件

1、 光学基础1.1什么是光？传统上说，光是人类眼睛可以看见的一种电磁波，也称可见光谱。在科学上的定义，光是指所有的电磁波谱。光是由光子为基本粒子组成，具有粒子性与波动性，称为波粒二象性。光可以在真空、空气、水等透明的物质中传播。对于可见光的范围没有一个明确的界限，一般人的眼睛所能接受的光的波长在380760nm之间。人们看到的光来自于太阳或借助于产生光的设备，包括白炽灯泡、荧光灯管、激光器、萤火虫等。光的实质：原子核外电子得到能量 跃迁到更高的轨道上 这个轨道不稳定 还要跃迁回来 跃迁回来释放出的就是一个光子 就是以光的形式向外发出能量 跃迁的能级不同 释放出来的能量不同 光子的波长就不同 光的

2、颜色就不一样了。电磁波谱0.1mm0.76m 0.4m10nm0.01nm无线电波红外线可见光紫外线X射线 射线31012hz3951012hz7501012hz301015hz301018hz10km 1km 0.1km1m1mm超长波长波中波短波超短波 微波30103hz0.3106hz3106hz300106hz0.31012hz 亚毫米波10m30106hz光是什么能引起人的视觉的电磁波不同的频率使人感觉到不同颜色1.3光的一些特性 白光是由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫等各种色光组成的叫做复色光。红、橙、黄、绿等色光叫做单色光。 色散：复色光分解为单色光而形成光谱的现象叫做光的色散。色散

3、可以利用棱镜或光栅等作为“色散系统”的仪器来实现。 特性：反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振等 红移在物理学和天文学领域，指物体的电磁辐射由于某种原因波长增加的现象，在可见光波段，表现为光谱的谱线朝红端移动了一段距离，即波长变长、频率降低（与蓝移相反）。红移的现象目前多用于天体的移动及规律的预测上。光学分析涉及到的概念1）散射 2) 折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同； 3) 反射4) 干涉 干涉现象；5) 衍射 光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；6) 偏振 光波电矢量振动的空间分布对于光的传播方向失去对称性的现象7）双折射：光束入射到各向异性的晶体，分解为两束光而沿不同方向折射的现

4、象。它们为振动方向互相垂直的线偏振光。 8）慢轴方向：在晶体有一个或个特定的方向，当普通光顺著这方向传播时并会产生双折射。这方向称之为光轴。在晶体的界面上，与光轴平的方向称为快轴，与光轴垂直的方向则称为慢轴。光的偏振2.1光谱分析 光谱分析法是基于物质发射的电磁辐射及电磁辐射与物质的相互作用而建立起来的分析方法。三个基本过程：（1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生被检测信号。特点：（1）所有光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。光分析法光谱分析法非光谱分析法原子光谱分析法分子光谱分析法原子吸收光谱原

5、子发射光谱原子荧光光谱X射线荧光光谱折射法圆二色性法X射线衍射法干涉法旋光法紫外光谱法红外光谱法分子荧光光谱法分子磷光光谱法核磁共振波谱法2.2.1光源 依据方法不同，采用不同的光源：火焰、灯、激光、电火花、电弧等；依据光源性质不同， 分为：连续光源：在较大范围提供连续波长的光源，氢灯、氘灯、钨丝灯等； 线光源：提供特定波长的光源，金属蒸气灯(汞灯、钠蒸气灯)、空心阴极灯、激光等；2.2.2单色器单色器：获得高光谱纯度辐射束的装置，而辐射束 的波长可在很宽范围内任意改变。主要部件：（1）进口狭缝；（2）准直装置(透镜或反射镜)：使辐射束成为平行光线； （3）色散装置(棱镜、光栅)：使不同波长的

6、辐射以不同的角度进行传播； （4）聚焦透镜或凹面反射镜，使每个单色光束在单色器的出口曲面上成像。2.2.2.1棱镜与光栅棱镜 对不同波长的光具有不同的折射率，波长长的光，折射率小；波长短的光，折射率大。平行光经过棱镜后按波长顺序排列成为单色光；经聚焦后在焦面上的不同位置上成像，获得按波长展开的光谱；棱镜的分辨能力取决于棱镜的几何尺寸和材料；棱镜的光学特性可用色散率和分辨率来表征；棱镜的顶角越大或折射率越大，角色散率越大，分开两条相邻谱线的能力越强，但顶角越大，反射损失也增大，通常为60度角；分辨率与波长有关，长波的分辨率要比短波的分辨率小，棱镜分离后的光谱属于非均排光谱。光栅：透射光栅，反射光

7、栅； 光栅光谱的产生是多狭缝干涉与单狭缝衍射共同作用的结果，前者决定光谱出现的位置，后者决定谱线强度分布； 光栅越宽、单位刻痕数越多、分辨率越大2.2.3光源与试样相互作用的场所2.2.4检测器 （1）光检测器 硒光电池、光电二极管、光电倍增管、硅二极管阵列检测器、半导体检测器；（2）热检测器 真空热电偶检测器：红外光谱仪中常用的一种； 热释电检测器：2.2.5. 信号、与数据处理系统 现代分析仪器多配有计算机完成数据采集、信号处理、数据分析、结果打印，工作站软件系统光谱分析仪器分辨率分辨率光学分辨率是衡量分光能力的重要参数。它取决于在被热敏元件探测时单色光的带宽。三个部件对分辨率有影响：入射

8、狭缝，光栅和探测器像素尺寸。细小的狭缝可以得到更好的分辨率，但降低了灵敏度；高刻划线的光栅增加了分辨率，但降低了光谱范围；较小的探测器像素尺寸增加了分辨率，但降低了灵敏度。3 滤光片用来选取所需辐射波段的光学器件。滤光片产品主要按光谱波段、光谱特性、膜层材料、应用特点等方式分类。 光谱波段：紫外滤光片、可见滤光片、红外滤光片； 光谱特性：带通滤光片、截止滤光片、分光滤光片、中性密度滤光片、反射滤光片； 膜层材料：软膜滤光片、硬膜滤光片； 硬膜滤光片不仅指薄膜硬度方面,更重要的是它的激光损伤阈值,所以它广泛应用于激光系统当中,面软膜滤光片则主要用于生化分析仪当中 带通型： 选定波段的光通过，通带

9、以外的光截止。其光学指标主要是中心波长（CWL），半带宽（FWHM)。分为窄带和宽带。短波通型(又叫低波通)：短于选定波长的光通过，长于该波长的光截止。 比如红外截止滤光片长波通型(又叫高波通)：长于选定波长的光通过，短于该波长的光截止 共聚焦显微镜的特点显微镜成像清晰度的决定因素:1.分辨率 指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。2.球差 由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。3.色差 由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有

10、不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。共聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。点扫描技术 将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。信号放大 电子图像 光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。软件 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。激光

11、共聚焦显微镜的优势在结构方面激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高可实现分层扫描可实现连续扫描，可动态记录变化可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像扫描速度快，对样品损伤小在应用方面形态观察-高清晰成像半定量-荧光强度分析荧光探针表达量测定定位研究-分层扫描多种荧光标记同时检测荧光标记物绝对定量分析扩展应用-如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等宽场照明显微镜和共聚焦图像比较应用高清晰成像半定量荧光强度分析荧光探针表达量测定分层扫描多种荧光标记同时检测荧光标记物绝对定量分析扩展应用共聚焦显微镜的应用领域（一）细胞生物学： 细胞结构：细胞骨架，细胞膜结构、流

12、动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡、细胞周期等。（二）生物化学：酶、核酸、荧光原位杂交、受体分析。（三）药理学：药物对细胞的作用及其动力学分析。（四）生理学： 膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布及其动态分析。（五）遗传学和胚胎学： 细胞生长、分化，细胞组织的三维结构，染色体分析，基因表达，基因诊断（六）神经生物学：神经组织、细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流。（七）微生物学和寄生虫学，细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；（八）病理学研究及病理学临床诊断： 活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，宫颈上皮细胞涂片诊断5 光学断层相干技术OCTO

13、ptical Coherence To ography 利用弱相干光干涉仪的基本原理，检测生物组织不同深度层面对入射弱相干光的背向反射或几次散射信号，通过扫描，可得到生物组织二维或三维结构图像。利用近红外线及光学干涉原理对生物组织进行成像。 干涉成像的原理简单地说就是将光源发出的光线分成两束，一束发射到被测物体（血管组织），这段光束被称为信号臂，另一束到参照反光镜，成为诶参考臂。然后把从组织（信号臂）和从反光镜（参考臂）反射回来的两束光信号叠加。但信号臂和参考臂的长度一致时，就会发生干涉。从组织中反射回来的光信号随组织的形状而显示不同强弱。把它与从反光镜反射回来的参考光信号叠加，光波定点一致时信号增强（增加干涉），光波定点方向相反时信号减弱（削减干涉）。分类目前OCT分为两大类：时域OCT（TD-OCT）和频域OCT（FD-OCT）。时域OCT是把在同一时间从组织中反射回来的光信号与参照反光镜反射回来的光信号叠加、干涉，然后成像。频域OCT的特点是参考臂的参照反光镜固定不动，通过改变光源光波的频率来实现信号的干涉。FD-OCT分为两种：（1）激光扫描OCT（SS-OCT），这种OCT利用波长可变的激光光源发射不同波长的光波；（2）光谱