蛋白酶活性的测定

1、时间：2021.03. 06卖脸四蛋勺酶活力的测定时间：2021.03. 06创作：欧阳道、卖唸目的1、了解蛋自酶活力测走的原理；2、拿握蛋勺酶活力测定的方比。二、卖验原理養自酶淮一文条件下不仅能够水鮮蛊自质中的肽 M,也能够水鮮lit胺键和酯键，因此可用養勺质或人工 合成的眦胺及酯类化合杨作为底炀来测定養仓酶的话 力。本卖验选用酪蛋自为底杨，测；t微生扬養自酶水解 肽锲的活力。酪蛋自经養自酶作用后，阵鮮成柑对分子 质量较小的肽和氣基酸，淮.反应混合杨中加入三氣醋酸 洽液，才目对分子质量较大的養勺质和肽就沉淀下来，相 对分子质量较小的肽和氣基酸仍紹柱涿液中，涿解于三 氣醋酸溶液中的肽的数量正比

2、于酶的数量和反应时间。 A 280nm波长下测定涿液吸光度的增加，就可计算酶 的活力。三、卖验试別微生扬卷勺酶萃取液（O.Olg/mlJ :称取l.Og酶制 利，加100ml蒸馆水搅拌30min,柱4C下离心分离 后，将上层请夜置于冰箔中保存，使用前科释一走信 数；0.02mol/L确酸盐缓冲液CpH7.5J ；1 %酪蛋勺涿液：取l.Og酪蛋自，加100ml 0.2mol/L 确酸盐缓冲液（PH7.5丿,加热并搅拌使它完全分散， 然后置于冰箱中保存；5%三氣睹酸fTCAJ涿液。四、卖验步骤1、将5%TCA涿液和1%酪養自涿液柱37C下保温。2、取叨支15ml具塞试管，分别标上记号Al、AO、

3、B1 和BOo亦A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，亦B1 和B0试管中各浹入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L璘酸 盐缓冲液定彖至2.00mlo柱 A0和B0试管中各浹入 6.00ml5%三氣睹酸嫁液，上述四支忒管都置于37C水 浴中保温。3、柱各试管中狹入2.00ml 1%酪養勺涿液，恵37C下 保温lOmin（准确计时丿后，再向A1和B1试管中吸入 6.00ml5%三氣醋竣溶液4、将试管从水浴中取出，柱宝温下放置lh,用少量上 请浚润湿滤纸j后过谑、，保毎谑、出液。5、淮.280nm波长下，分别以A0和B0谊液为空自，测X A1和B1滤液的狹光度。五、计算1、柱规定的卖验条件下

4、，以毎分钟增加0.001狹光度 定义为一个酶单佞2、每克酶制利中酶活力的计算： A X 1000/(t X w) 酶活力单住/克酶制剂 式中，AA样与空勺吸光度差值卩A1和B1 的狹光值丿；t酶作用时间(本卖验为lOminJ ； w反应中酶的用量，g六、说朗1、微生物蛋自酶粗提取液柱较宽广的PH施幽表现出 活力，但是往接近中性条件下最有最嵩活力。2、微生杨蛋勺酶柱45C以下可保持较长时间的稔定 性。七、思考題1、蛋勺酶有哪几类？2、影响酶活力的因素有哪些？3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问題？六、數捱记录与处理A1 = 0.279 Bl =0.573 酶含量为 0.001 g/ml酶活力 1

5、 = AA x 1000 /(t x w)=0.279x1000/10/0.001/0.20=1.395X105 酶活力单 住/克酶制別酶活力 2= A A x 1000 / (t x w)= 0.573x1000/10/0.001 /0.40= 1.4325 x 1 O酶活力 单伎/克酶制刘平均值=C1.395x105+ 1.4325x105J =141375 酶活力 单住/克酶制剂平均相对相差=f 143250- 139500J /141375 x 100%=2.65%七.思考題1、餐自醉有哪几类？答：按養勺酶水鮮蛋勺质的方式：A内肽酶：切 开蛋勺质分子内部肽縫，生成相对分子质量较小的多肽

6、 类；B外肽酶：切开蛋勺质或多肽分子氣基或象基末端 的肽钱，而游富出氣基酸的酶类；C水鮮養勺质或多肽 的酯縫；D水鮮養勺质或多肽的犹胺键。按酶的来源 可分为：动扬蛋自酶、植物蛋合酶、微生物蛋勺酶微生杨養勺酶又可分为：细菌蛋自酶、霉苗蛋合酶、 酵母蛋合酶和放线茵蛋勺酶按妥自酶作用的最适.PH可以分为fAj PH2.55.0的 酸性蛋自酶，CBJ PH9.510.5的喊性養台酶，(C) PH78的中性蛋合酶2、影响酶活力的因素有呷些？答：酶活力是酶傕化某一化学反应的速率来表示 的。酶活力的大小即酶含量的多少，可以用毎克酶制剂 或每毫升酶制刘令有多少酶单住来表示，酶活力的测走 也就是测定酶促反应的速

7、率。酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子 的浓度呈正比，在一定范爾内，当底杨分子浓度足够 时，酶分子越多，底扬转化的速度越快。底物浓度对酶活力的影峋：若酶的浓度为良值， 底扬的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正 比，即随底扬浓度的增加而增加。多所有的酶与底场结 合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓 度也不会增加，酶促反应速度也不会增加。温度对酶活力的彩响：在适宜的温度范爾内，酶 促反应速度随温度升寓而增加，超过最适反应温度，酶 活力将会下阵。PH对酶活力的影响：酶征最适PH范爾内表现出 活性，大于或小于最适PH,都会阵低酶活性。激话剂对酶活力的影响：某些无机阳禽子、阴富 子、有机化合物可作为激活利，能够激活酶，使其表现 出催化活性或强化其傕化活性。抑制剂对酶活力的影响：酶的抑制利能够减弱、 抑制芯至玻坏酶的活力，它可阵低酶促反应速度。3、後用紫外分光光度计对应注意邓些问題？答：使用的比色皿必须洁净，并注意配对使用。 手指应拿毛玻璃面的两側，裝盛样品量以2/3为度。it 光面要用擦镜纨擦拭干