分子免疫学-免疫球蛋白课件

1、分子免疫学 免疫球蛋白分子免疫学 免疫球蛋白 免疫球蛋白抗体的发现及特性免疫球蛋白的分子结构免疫球蛋白分子的功能抗体的异质性免疫球蛋白基因的遗传控制抗体的制备思考题 免疫球蛋白抗体的发现及特性抗体的发现及特性1890年，Behring发现抗毒素40年代，Tiselius 和 Kabat 采用电泳技术研究抗体1968年 WHO决定Back抗体的发现及特性1890年，Behring发现抗毒素Back1890年， Behring发现白喉外毒素 动物（发病） 提取血清 注射另外动物 血清+毒素 动物不发病 动物不发病 说明：血清中存在一种能中和毒素的部分： 抗毒素（抗体Antibody， Ab） 刺激

2、机体产生抗体的物质： 抗原（Antigen， Ag）白喉外毒素Back1890年， Behring发现白喉外毒素 40年代，Tiselius 和 Kabat40年代，Tiselius 和 Kabat 当时认为：抗体就是球蛋白 （丙球），丙球就是抗体。 后来发现：抗体大部分局限在区， 少部分延伸至其它区。BackBack1968年 WHO决定将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的 球蛋白统称为-免疫球蛋白 （Immunoglobulin，Ig） 分泌型：血清抗体 膜型：B细胞膜上的抗原受体 将机体受抗原刺激后出现的能与抗原发生 特异性结合，具活性的球蛋白-抗体 （Antibody，Ab） 抗体是I

3、g，而Ig并非都是抗体Back1968年 WHO决定将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的二 . 免疫球蛋白分子结构基本结构立体结构功能区其他成分水解片段Back二 . 免疫球蛋白分子结构基本结构Back（一）基本结构组成命名分区Back（一）基本结构组成Back组 成 由一对较长的和一对较短的多肽链组成 四条多肽链 长链：重链（Heavy Chain， H链）， 450-550 aa， 55-57 KD 短链：轻链（Light Chain， L链）， 214 aa， 24 KD 二硫键：H链和L链之间，两条H链之间 由二硫键连接，呈Y型组 成 由一对较长的和一对较短的多肽链组成 BackN端C

4、端BackN端C端命 名H链：分五类 、 、 、 、 链 IgD 、IgM、 IgG、 IgE、 IgA L链：分两型 型和型Back命 名H链：分五类 Back分 区 N端：aa序列变化（110个残基） C端 ：则相对稳定（1）可变区（Variable region， V区） 近N端：V区= 1/2 L链+ 1/4（1/5）H链 （2）恒定区（Constant region， C区） 近C端：C区= 1/2 L链+ 3/4（4/5）H链 （3） 铰链区分 区 N端：aa序列变化（110分子免疫学-免疫球蛋白课件 高变区（hypervariable regio，HVR） 可变区中某些区域的aa

5、组成和排列特别 易变化或具更高的变易性。VL 28-35 49-56 91-98VH 29-31 49-58 95-102 HVR1 HVR2 HVR3 CDR1 CDR2 CDR3CDR（互补决定区）：Ig的抗原结合部位和抗原 表位互补结合部位，决定抗体的特异性。可变区 高变区（hypervariable r分子免疫学-免疫球蛋白课件铰链区位于CH1和CH2之间，富含脯aa， 富有弹性，可自由折叠 意义： 能使V区与不同距离的抗原结合 补体结合位点易于暴露 IgM和IgE无铰链区Back铰链区位于CH1和CH2之间，富含脯aa，Back立体结构立体结构分子免疫学-免疫球蛋白课件BackBac

6、kIg 功能区 L链： VL 、 CL H链： IgG、IgA、IgD： VH、 CH1、CH2、CH3 IgM、IgE：VH、 CH1、CH2、CH3、CH4Ig 功能区 L链： VL 、 CL分子免疫学-免疫球蛋白课件功能区的作用 VL、VH： 抗原结合部位 HVR（CDR）与抗原表位结合 CH1、CL：遗传标志所在 IgG- CH2：补体结合位点，通过胎盘部位 CH3：与各种组织表面IgG Fc受体 （FcR）结合部位IgM： CH3 ：补体结合位点IgE： CH2、CH3 ： 与肥大细胞、嗜碱性 粒细胞的 （ IgEFc受体FcR）结合部位Back功能区的作用 VL、VH： 抗原结合部

7、位 Ig的其他片段 J链 （Joining Chain）： 连接两个或两个以上Ig单体作用 SIgA：二聚体 IgM： 五聚体分泌片SP（Secretory Piece）： 是SIgA上 的一个辅助成分 上皮细胞合成，分泌到黏膜细胞表面 作用：具抵抗外分比液中蛋白水解酶 的降解作用，稳定SIgA的作用。Ig的其他片段 J链 （Joining Chain）：分子免疫学-免疫球蛋白课件分子免疫学-免疫球蛋白课件BackBack水解片段 木瓜蛋白酶 IgG 2Fab段 + Fc段 （ 抗原结合片段）（可结晶片段） 胃蛋白酶 IgG F（ab）2段 + pFc段 （ 抗原结合片段） 碎片意义：F（ab

8、）2段保持了与抗原结合的生物学活性， 又减少了 Fc段的生物学活性。可应用于生物 制品研究，如精致抗毒素等。水解片段 木瓜分子免疫学-免疫球蛋白课件BackBack三免疫球蛋白的生物学特性 特异性结合抗原： 活化补体： IgM，IgG1，IgG2，IgG3-经典途径 凝聚的IgA，IgG4，IgE -旁路途径结合Fc受体： Ig + Ag Ig的 Fc段活化 与细胞表面的Fc受体结合通过胎盘Back三免疫球蛋白的生物学特性 特异性结合抗原：Back 与Ag的结合具有高度特异性，必须是超变区与抗原的空间构象完全吻合。 与抗原结合后，可介导体内的多种生理和病理效应（中和病毒、毒素，介导炎症反应），

9、体外可产生凝集、沉淀现象用于检测等 Back特异性结合抗原Back特异性结合抗原结合Fc受体介导I型超敏反应调理吞噬作用发挥ADCC作用Back结合Fc受体Back介导I型超敏反应： IgE由于其Fc段结构的特异性， 可在游离情况下与相应的Fc受体结合 肥大细胞 IgEFcR 嗜硷性粒细胞一旦Ag与IgE结合，触发细胞脱颗粒，产生I型超敏反应。Back介导I型超敏反应：Back调理吞噬作用：抗原与抗体结合后，能增强吞噬细胞的吞噬活性。Back调理吞噬作用：抗原与抗体结合后，能增强吞噬细胞的吞噬活性。发挥ADCC作用 靶细胞抗原 + IgG IgGFc段活化 + FcR 中性粒细胞，单核细胞，

10、M，NK 发挥对靶细胞的直接杀伤作用发挥ADCC作用 靶细胞抗原 + IgG BackBack通过胎盘IgG ： 唯一通过胎盘的免疫球蛋白 母体的IgG CH2 滋养层细胞内吞 主动外排 胎儿体内吞噬囊泡中有IgG的Fc受体而无其他Ig受体，且IgG与FcR结合后得以避免被酶水解通过胎盘IgG ： 唯一通过胎盘的免疫球蛋白 BackBack三. 抗体的异质性 抗原A/B-机体-抗体A/B (识别不同抗原) Ig可变区（CDR）差异抗原A-机体-抗体A（IgM/IgG） （识别同一抗原） Ig恒定区差异 抗体异质性抗体分子的多样性三. 抗体的异质性 抗体恒定区的异质性Ig 类型 抗体异质性产生因

11、素 外源性Ig 多样性 内源性Ig 血清型 BackBack1）类与亚类： 类： IgG、 IgM 、IgA、IgD、IgE 亚类：IgA：IgA1、IgA2（ 1、 2） IgG：IgG1IgG4（1、 4） 尚未发现 IgM，IgD， IgE有不同亚类2）型与亚型： 型：和，：=2：1 （人） 亚型：1-4 四个亚型Ig 类型1）类与亚类： 类： IgG、 IgMIg 多样性 自然界多种不同的抗原（表位）诱导 机体产生多种不同的特异性抗体 同一种抗原（表位）诱导机体产生特 异性相同、类型不同的抗体Ig 多样性 自然界多种不同的抗原（表位）诱导Ig 血清型 Ig具有双重性： 与相应抗原发生特

12、异性结合抗体特性 可诱导机体产生特异性抗体抗原特性 类型：同种型、同种异型、独特型Ig 血清型 Ig具有双重性：Back同种型（Isotype） 存在同种抗体分子中的抗原表位 同一种属所有个体Ig分子共有的抗原特异性标志 具种属特异性，为种属型标志，存在IgC区。Back同种型（Isotype） 存在同种抗体分子中的抗原同种异型（Allotype） 同一种属不同个体间的Ig分子所具有的不同抗原特异性，因而可在同种异体间诱导免疫反应。为个体型标志，存在IgC区、V区。Back同种异型（Allotype） 同一种属不同个体间的Ig分子所独特型（Idiotype，Id） 同一个体不同抗体形成细胞所产

13、生的Ig分子的V 区的抗原性不同（CDR 序列）。 A1 B1 Ab1 A2 机体 B2 Ab2 （HVR序列）A3 B3 Ab3 B4 Ab4（抗-Ab1） B5 Ab5（抗-Ab2） B6 Ab6（抗-Ab3） 独特型抗原表位（Id）- 抗独特型抗体（AId）独特型（Idiotype，Id） 同一个体不同抗体形Back独特型表位独特位， 存在Ig的V区Back独特型表位独特位， 存在Ig的V区五免疫球蛋白基因的遗传控制Ig的基因定位和基因库Ig基因片段重排Ig的基因多样性Ig的基因生物合成Ig的类型转化Back五免疫球蛋白基因的遗传控制Ig的基因定位和基因库BackIg的基因定位 免疫球蛋

14、白基因定位 编码的肽链 基因符号 基因定位（人） H 链 IGH 第14号 链 IG 第 6 号 链 IG 第16号Ig的基因定位 免疫球蛋白基因定位基因库 H链： VH： VH， DH， JH （可变区基因、多样性基因、连接基因） CH： 5- C-C-C3- C1-C1- C2- C4-C- C2-3 L链： 链： V，J C 链： V J -C （JC两群基因并不分开）Back基因库 H链： Back人类H链基因重排 V区： VH：功能基因片段约51个，编码靠N段 的CDR1，CDR2和3个骨架区（FR1-3） DH：功能基因片段约30个，编码CDR3 JH： 功能基因片段约6个，编码F

15、R4 基因重排：首先 D与J基因连接形成D-J基因， 然后与V基因连接形成V-D-J基因 C区：通过RNA剪接来实现Ig类型转化FR3FR2FR1FR4CDR1CDR2CDR3人类H链基因重排 V区：FR3FR2FR1FR4CDR1C人类L 链基因重排VL 编码CDR1，CDR2区JL 编码CDR3区CL 编码恒定区链： V：功能基因片段50个 J： 功能基因片段5个 C: 功能基因片段1个链： V：50-100个基因片段 J -C ：基因不可分，有4个基因组 链重排失败，再进行链重排FR3FR2FR1FR4CDR1CDR2CDR3人类L 链基因重排VL 编码CDR1，CDR2区FR3Back

16、Back基因重排基因重排分子免疫学-免疫球蛋白课件 L VH Cm1.胚系基因2.基因重排3.重排基因4.RNA转录本5.mRNA剪切6.成熟mRNA7.Igm前体多肽 V1 V2 V3 Vn D1 D2 D3 Dn J1 J2 J3 J4 Cm Cd Cg Ce Ca V1 V2 D2 J3 J4 Cm Cd Cg Ce Ca V1 V2 D2 J3 J4 Cm Cd Cg Ce Ca V2D2J3 J4 Cm Cd V2D2J3 Cm Cd V2D2J3 CdCmJ4J4 V2 D2 J3 Cm V2 D2 J3 Cd L VH Cd Ig 重 链 基 因 重 排 L VH 日本-利根川B

17、ack日本-利根川BackIg的基因多样性形成机制组合造成的多样性连接造成的多样性体细胞高频突变造成的多样性BackIg的基因多样性形成机制组合造成的多样性Back组合造成的多样性（combinatorial diversity） 众多的V区基因片段的组合和轻重链的组合， 众多的V、D、J基因中，重排时每个片段只能取一个， 就存在多种组合。 VH： 51个基因片段，编码CDR1、CDR2部分的aa DH： 30个基因片段，编码CDR3中的大部分aa JH： 6个基因片段，编码其余的CDR3部分的 aa 和第 四个骨架区 VH链：51 x 30 x 6 = 9180 种 V： 50个基因片段 J

18、： 5个基因片段 V链： 50 X 5 = 250 种 V：30个基因片段 J：4个基因片段 V链： 30 X 4 = 120 种Back组合造成的多样性（combinatorial divers连接造成的多样性(junctional diversity)CDR3区位于V、J和V、D、J片段连接处，两片段之间可插入或丢失数个核苷酸，增加了互补决定区（CDR3）的多样性。N-氨基酸插入 Back连接造成的多样性CDR3区位于V、J和V、D、J片段连接 V、D、J片段连接多样性Back V、D、J片段连接多样性BackN-氨基酸插入BackN-氨基酸插入Back体细胞高频突变造成的多样性(soma

19、tic hypermutation) 成熟的B 细胞重排的V区基因，往往在抗原的刺激下发生点突变，突变的频率非常高（每次细胞分裂，大约每1000个bp中就有一对发生突变，而其他体细胞的突变频率为10-10bp。）。 称为体细胞高频突变。 有人计算多样性可达4.8 X 107 ，故针对外界众多的抗原分子，体内可产生数以亿计的不同抗体分子。 Back体细胞高频突变造成的多样性(somatic hypermu免疫球蛋白的生物合成Ig主要由脾、淋巴结和其他淋巴组织内的桨细胞所产生。重链和轻链分别合成，然后装配。Ig的合成过程：转录、mRNA剪切、合成重链和轻链；在粗面内织网装配四肽链；转运、加糖基、分

20、泌胞外。B细胞在抗原刺激后，最初只合成IgM，后合成IgG。Back免疫球蛋白的生物合成Ig主要由脾、淋巴结和其他淋巴组织内的桨免疫球蛋白类型转换 指一个B细胞克隆在分化过程中V区基因不变，而CH基因片段不断发生重排，即识别抗原的特异性不变，但Ig分子的类和亚类发生变化。 Ag 机体 B细胞 先IgM（VDJC） 后IgG （VDJC） V区：V-D-J基因不变，识别抗体能力不变 C区：C转换为C，从IgM-IgGBack免疫球蛋白类型转换 指一个B细胞克隆在分化六抗体的制备1.多克隆抗体（Polyclonal antibody, PAb） 第一代 抗体2. 单克隆抗体（Monoclonal

21、antibody，McAb） 第二代抗体3.基因工程抗体（gentic engineering antibody） 第三代抗体 六抗体的制备1.多克隆抗体（Polyclonal ant多克隆抗体 1 2 B1 Ab1 3 机体 B2 Ab2 B3 Ab3 蛋白质抗原 多种抗体的混合物 存在于血清与体液中 由含多种抗原表位的抗原刺激机体产生的免疫 血清，含多种抗体的混合物，称多克隆抗体。Back多克隆抗体 单克隆抗体（McAb）由识别一个抗原表位的B细胞克隆所产生的均 一的抗体。 特点：纯度高，特异性强。 两位科学家在1975年首创杂交瘤技术制造 McAb，并于1985年获诺贝尔奖。 1974年

22、，Koehler在Milstein位于剑桥的实验开始博士后研究，两人为研究抗体的多样性，对抗体形成细胞与骨髓瘤细胞进行融合试验。单克隆抗体（McAb）原 理 小鼠骨髓瘤细胞（浆细胞瘤细胞）能在体外无限 制增殖和分泌无活性的Ig（单一）。 小鼠脾细胞（富含B细胞）具有产生特异性抗体 的能力，但不能无限制繁殖传代。 采用融合剂将两种细胞融合成杂交瘤细胞，具有 亲代双方的特性：即能人工培养使之无限止繁殖， 又可产生特异性抗体。 由于每一个B细胞克隆只针对一个抗原表位，产生 相对应抗体，通过筛选单个外细胞，在体外增殖 而形成的细胞克隆只产生完全均一（类、亚类、 型等）的单一特异性Ab，即McAb。原

23、理 小鼠骨髓瘤细胞（浆细胞瘤细胞）能在体外无限 抗原免疫的小鼠脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （产生抗体， （不含 HGPRT和TK, 体外不能长期存活） 体外能长期存活） 混合后加 融合剂（PEG或仙台病毒等） HAT培养基中培养 次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T） 为合成核酸的原料，氨基喋呤（A）能 阻止正常合成核酸途径 未融合脾细胞或 未融合瘤细胞或 杂交瘤细胞 自相融合脾细胞 自相融合瘤细胞 （死亡） （死亡） （存活） 抗原免疫的小鼠脾细胞 分子免疫学-免疫球蛋白课件分子免疫学-免疫球蛋白课件应 用 单克隆抗体由于纯度高、效价高、特异性强，广泛应用于诊断、治疗、研究。 但目前临床应用的均为鼠

24、原性McAb，对人来说是异物，具有抗原性，从而限制了体内的应用，尤其是抗体导向治疗肿瘤的方法。因而，有了第三代Ab，即基因工程抗体Back应 用 单克隆抗体由于纯度高、效价高、特异性强，广泛基因工程抗体概念嵌合抗体： 第一代基因工程抗体改型抗体： 第二代基因工程抗体小分子抗体：第三代基因工程抗体Back基因工程抗体概念Back基因工程抗体概念根据研究者的意图，在基因水平对Ig分子进行切割，拼接或修饰，甚至是人工合成后导入受体细胞表达大，产生的新型抗体。 由于可用人体的aa序列代替某些鼠源性抗体的aa序列，保留其结合抗原的特异部位，再经修饰而成。故又称：人源化抗体。 且：可从最小抗原结合位点（高变区）Fv片段到F（ab）片段，甚至整个Ig分子，因而免疫原性大大地减少。Back基因工程抗体概念根据研究者的意图，在基因水平对Ig分子进