基因工程抗体及其发展前景

1、基因工程抗体及其发展前景第1页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二主要内容第一节:基因工程抗体的基本原理：第二节:人源化抗体制备的主要方法：第三节:抗体靶向治疗的新的思考：第四节:工程抗体的未来发展与展望：第2页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第一节：基因工程抗体的基本原理 (antibody engineering）第3页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Antibody has a higher specificity and affinity to bind to target protein. 药物(drug)：是一类分

2、子（化学合成物，蛋白质，核酸等）可以干扰人体内细胞生命过程中一些重要的生理和病理活动或通路。第4页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二基因抗体：通过基因工程手段，保留抗体重轻链可变区中主要与抗原结合的CDR功能区, 而形成的各种功能抗体Complementary-determining regions: CDR第5页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二基因工程抗体的分类第6页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二基因工程抗体的分类2.小分子抗体（1）Fab片段（2）单链抗体（single chain antibody，scFv）、双链抗

3、体、三链抗体（3）微型抗体（minibody，两个scFv与抗体CH3区连接）（4）双特异性抗体（diabody）（5）其他形式抗体（细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体、最小结合单位等）第7页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二抗体药物在应用中存在的问题：一般必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，故所得鼠源性单抗，必须人源化，在临床上可减少异源性蛋白所引起的过敏反应和增加疗效。鼠源抗体人源化后，抗体效价明显降低，导致临床疗效降低。临床治疗需要大量的抗体(克级），故需要生物反应器制备抗体。由于抗体的产量和质量受到限制，而影响疗效。问题:工程细胞系,大规模生产工艺技术第8页，共74页，202

4、2年，5月20日，22点21分，星期二基因工程抗体的优点和缺点优点：不受动物品系（species)和抗体类型（isotype)的限制。利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。缺点：抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。第9页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二目的： 减小鼠源性成份，降低HAMS反应（human against mouse syndrome)。 易于大规模生产和应用于临床。 保留抗体的抗原结合能力。基本原理： 借助基因工程手段，将编码Ab的重轻链可

5、变区基因重组到真核表达载体上并进行表达。第10页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二基因工程抗体的表达原核细胞和酵母可以用于表达小分子抗体和抗体片段大部分完整抗体和双链抗体、微型抗体等需要在CHO等哺乳动物细胞中表达利用完整的动植物体通过转基因的方法表达外源蛋白：如利用转基因烟草生产抗狂犬病毒抗体第11页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二抗体工程的发展历程动物多克隆抗血清被抗生素所代替成份复杂，副反应严重鼠源单克隆抗体1975年，杂交瘤技术制备单抗成功“魔弹”HAMA反应20世纪90年代初，抗内毒素单抗用于治疗脓毒败血症遭遇失败。抗体药物的研究进入低谷

6、。分子生物学基因工程技术基因工程抗体鼠源抗体的人源化及形式多样的改造抗体抗体工程就是指利用分子生物学、基因工程等手段对抗体进行各种不同的改造并在原核、真核细胞中表达制备的工程技术。马血清,破伤风,狂犬病第12页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二The Evolution of Therapeutic AntibodiesMurineFully HumanHumanizedChimeric100% mouse protein34% mouse protein5 - 10% mouse protein100% human proteinPotential for Immuno

7、genicityHighLowLonberg N. Nat Biotechnol. 2005;23:1117-1125.Ternant D, et al. Expert Opin Biol Ther. 2005;5(Suppl 1):S37-S47. Yang X-D, et al. Crit Rev Oncol Hematol. 2001;38:17-23.Weiner LM. J Immunother. 2006;29:1-9.嵌合抗体人源化抗体全人抗体第13页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第14页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第二节：

8、基因工程抗体制备的主要方法：第15页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二1.人鼠嵌合抗体（Chimeric Antibodies）原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与原抗原的特异性结合。缺点：鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反复使用在人体产生抗体及过敏反应（HAMS反应，human against mouse syndrome)。嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降低，但亲和力明显下降。第16页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Chimeric antibodi

9、es杂交瘤细胞株获得两个可变区克隆载体(T载体)原核表达系统检测构建表达载体RT-PCR酶切测序酶切，连接转化是是否否酶切，连接1。获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段。2. 基因片段插入含有人IgG重轻链恒定区的表达载体。第17页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二人鼠嵌合抗体的真核表达在CHO细胞（共转染模式和单载体转染模式） 第18页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Until 2003,7，8437 people have been infected with SARS over the 32 countries, in which 813 pat

10、ients were died form disease. The disease incidence is about 10.5%. There are many unresolved questions about disease pathogenesis, treatment and diagnosis.第19页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二2. humanized antibodiesHumanization or reshaping of murine antibodies is an attempt to transfer the full antigen

11、 specificity and binding avidity of murine monoclonal antibodies to a human antibody by grafting the murine complementarity determining regions (CDRs) onto a human variable region framework。保留鼠CDR的人源化Ab65 to 90%第20页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二MouseHumanHumanisedhypervariableframework第21页，共74页，2022年，

12、5月20日，22点21分，星期二humanization-CDR grafting CDR residues from variable region of a mouse mAb are transferred to human antibody frameworks that have high sequence homology with the mouse counterparts第22页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Humanized AntibodiesAllows specificityAllows effector functionsLess immu

13、nogenic第23页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二humanization-advantageMurine mAbs have been extensively characterized and have desirable antiviral properties and/or superior fully human mAbs are hardto obtain. This viable approach is the classic and simplest strategy of humanization among many other availabl

14、e strategies, such as grafting specificity determining residues17.The fact that nearly half of all US Food and Drug Administration (FDA)-approved therapeutic mAbs are humanized antibodies testifies to their safety and tolerance by humans.第24页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二3。Fully human mAbs 1）。transgen

15、ic mice 2）。Human antibody-display libraries3）。To make Human mAb from human being全人抗体100%第25页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二1） Transgenic mice首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。上二种小鼠回交，获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。第26页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Creation of Fully Human mAbs From Transgenic Mic

16、eReplace murine immunoglobulin (Ig)G genes with human IgG genesWeiner LM. J Immunother. 2006;29:1-9.Yang X-D, et al. Crit Rev Oncol Hematol. 2001;38:17-23.Mouse strain incapable ofproducing mouse antibodiesHuman Ig lociBreedingBreedingMouse embryonic stem cells containing human antibody genesMouse s

17、train producinghuman and mouse antibodiesMouse embryonic stem cells with inactivated mouse heavy and light chain lociMouse Ig lociMouse strain producingonly human antibodies第27页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Transgenic mouse-advantageHave a repertoire of fully human IgG1 gave researchers an alternative

18、 route to human mAbs through active immunization, without the protocol restrictions associated with human studies. 第28页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Transgenic mouse-drawbacksAs the immune response in transgenic mice is sometimes less robust than in strains that are used to generate mouse mAbs, more i

19、mmunizations or antibody screens are often required.These transgenic mice cannot exactly reproduce the human antibody response because of repertoire differences and because the genetic background ofthe murine host affects antigen processing, B-cell ontology and regulation (e.g.,tolerance mechanisms)

20、. At present, these transgenic mice are protected intellectual property and therefore not commonly available第29页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二2）噬菌体抗体库技术(Phage antibody library technique)把人的Ig重轻链可变区基因片段展示在l噬菌体表面,组成抗体库。通过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正常人）。高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和力低。第30页，共74页，20

21、22年，5月20日，22点21分，星期二scFv-single-chain variable fragments第31页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Display technologies-strategy第32页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Phage Display Library-Antibody library-from Immunology Today (2000), 21, 371-378第33页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Flowchart of Phage Display ApplicationD

22、isplaying Targets on Filamentous Phage Panning (Selection) of The Phage LibraryExpression the Protein Fragmentor Isolation of Affinity-Purified Phage ClonesLibrary clonesExpressionIsolation第34页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Start from human genesNew specificities?Less immunogenic?Can screen a larger re

23、pertoireLoss of combinatorial specificitiesBypass immunisation naive libraryLow affinityAffinity maturation in vitroExtra steps, more immunogenic?Economical production in bacteria Only fragmentsPhage Display - advantages第35页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Phage Display - drawbackUnnatural pairings of th

24、e antibody heavy and light chain componentsThe method of presentation of antigen as bait for panning may affect the number and distribution of available neutralizing epitopes.第36页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Nave or immunizedKey pointFunctional Ab第37页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二3）用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体关键点：

25、建立好的人骨髓瘤细胞。稳定性高和融合率高。(Human antibodies 2002, 11:85-96)第38页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二MousemyelomaHumanmyelomaDouble selecting markers G418 and HATHuman LN B cells第39页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Breast cancer tissue Breast cancer cells We work on HCV/E2 mAb and Rabbis virus S protein by using FMP2 c

26、ells.第40页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二4. B细胞永生化技术：用EB病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的B细胞克隆。这一技术较为成熟，但是存在抗体分泌不稳定的缺点，限制了其应用。或直接分离分泌抗体的B细胞,用PCR获得重轻连,构建全人抗体.第41页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二B cell immortalization:EBV TransformationEpstein-Barr virusWhen EBV infects B-lymphocytes in vitro, lymphoblastoid cell lines eve

27、ntually emerge that are capable of indefinite growth.The growth transformation of these cell lines is the consequence of viral protein expression.第42页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二B cell immortalizationMemory B-cells are obtained from the blood of an individual recovering from a virus infection. There

28、by obviating the need for a fusion step to generate hybrid cells, as in the hybridoma technique.第43页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Memory B-cell immortalizationMemory B cells isolated from PBMCImmortalized by EBV in the presence of a CpG oligodeoxynucleotide and irradiated allogeneic PBMCs第44页，共74页，202

29、2年，5月20日，22点21分，星期二Related paperMemory B-cells isolated from the blood of individuals who have recovered from SARS-CoV and H5N1 avian influenza infections have been immortalized using this method to produce nAbs against these viruses.Traggiai, E. et al. An efficient method to make human monoclonal a

30、ntibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10,871875 (2004).Simmons, C.P. et al. Prophylactic and therapeutic efficacy of human monoclonal antibodies against H5N1 influenza. PLoS Med. 4, 178 (2007).第45页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Single B cell RT-PCR Nature B

31、iotechnology,2008,26:886-887.第46页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二the strategy of single cell RT-PCR第47页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二The time frame-one month第48页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二各种全人抗体生产技术比较优点缺点微生物表面展示技术很成熟，体外进行抗体亲和力的完善，抗体的重轻链不是天然配对，没有在体外还原天然抗体的构象转基因小鼠可以产生全人免疫球蛋白库，不受到人体试验的限制转基因老鼠还是并不能生产精确的全人抗体E

32、BV病毒转化EBV病毒转化产生的B细胞杂交瘤用于产生中和抗体，材料来源广泛B细胞杂交瘤存在染色体不稳定，易丢失的缺陷单个B细胞RT-PCR方便，常规分子克隆实验条件快速，条件优化后仅需要30天高通量，针对抗原特异抗体库亲和力和特异性：亲和力很高，获得针对抗原各表位的抗体适用通过疫苗治疗的各种疾病慢期炎症或致死性病原体如HIV，癌症和自身免疫病方面应用受到限制第49页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Source of antibodies on the market(according to a “market analyst”)SourceAntigenicity% H

33、umanMouse+0 %Chimeric+60-70%Humanised- 90%Human-100%第50页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第三节：抗体靶向治疗的新思考问题1：在临床上抗体用量大（几百毫克到克级）， 价格昂贵。在不发达国家难于承受。问题2：由于专利限制，中国难于进行me too药仿制。解决方案：能否利用中和性抗体的靶向作用，确定 抗体作用的靶点位子，用小分子替代， 设计新药？第51页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二Since a neutralized mAb is valuable in disease treatment,

34、 the techniques used here allow us to identify core functional regions of given receptor/ligand.therefore, there is a potential to design rational mimicking molecules based on the identified region.Defining the functional region of ligand or receptor recognized by neutralizing mAb will be essential

35、in identifying novel drug targets. Prospective展望第52页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二抗体药物发展现状FDA已批准上市的抗体药物SFDA(中国)已批准上市及临床研究的的抗体药物第53页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第54页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第55页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第四节：工程抗体的未来发展与展望1. 单克隆抗体的市场需求第56页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二 对20042011年全球治疗单抗市

36、场的预测及分析第57页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二2. 抗体药物的应用领域抗器官移植排斥反应；肿瘤导向治疗； 哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病； 心脑血管疾病；感染性疾病；其他第58页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二四种抗体的临床应用概况第59页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第60页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第61页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第62页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二第63页，共74页，2022年，5月20日，22点21分，星期二小分子抗体分子量小，穿透性强，抗原性弱，表