一种蛋白纯化的新思路,新方发法复习课程

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。一种蛋白纯化的新思路,新方发法SSB亲和层析使用说明书简介噬菌体T7单链DNA结合蛋白（SSB,single-strandedDNAbindingprotein）由696bp核苷酸编码，计算分子量为25.6kDa（SDS凝胶电泳，该蛋白条带约在27kDa位置）。它与单链DNA有很强的亲和性，且无序列特异性。利用这一特性，将SSB构建到不同宿主的表达载体中，可以实现在不同宿主中表达带有SSB标签的融合蛋白，从而与偶联在介质中的单链DNA高效、特异性结合，这种结合是可逆的，能够在温和、非变性的条件下通过改变

2、洗脱液的pH值或盐浓度对融合蛋白进行洗脱，达到纯化某一目标蛋白的目的。pSSB系列载体用于构建可诱导、高水平表达的基因或基因片段，表达的融合蛋白的N端或C端带有SSB标签。SSB标签可根据需要由位点特异的蛋白酶切除，pSSB系列质粒上多克隆位点上游包含有肠激酶（enterokinase）、凝血酶、TEV等识别序列。带有标签的蛋白可以通过免疫学方法进行检测，同时根据实验需要决定是否切除标签。SSB亲和层析介质（经过特殊处理的ssDNA-cellulose）是专门设计用于纯化SSB融合蛋白及与目的蛋白有亲和作用的蛋白复合体的分离介质，通过盐离子梯度洗脱可得到高纯度的SSB融合蛋白。纯化条件温和，不

3、引入其他物质，能够保证蛋白的活性。pSSB载体现有的pSSB载体系列按宿主不同可以分为以下四类：1）大肠杆菌类;2）酵母类;3）人细胞类；4）昆虫细胞类。每一个类别中均含有带有N端和C端的SSB标签质粒，每个质粒都含有相应的蛋白酶切位点，可以根据实验需要，将SSB标签从融合蛋白中切去。在不同的宿主载体中，它们的启动子也各不相同，通过各自的启动子实现严格调控插入片段的表达。相关参数如下页表一所示：表一：pSSB系列载体宿主载体SSB位于目的蛋白的N端或C端抗性启动子蛋白酶切位点是否带His标签大肠杆菌E.colipSSB-E1N端卡纳抗性T7肠激酶否pSSB-E2N端卡纳抗性T7肠激酶是pSSB

4、-E3N端（SSB(26C)标签）卡纳抗性T7肠激酶是pSSB-E4N端卡纳抗性T7凝血酶是pSSB-E5N端卡纳抗性T7凝血酶否pSSB-E6C端卡纳抗性T7肠激酶是酵母YeastpSSB-Y1N端卡纳抗性nmt1肠激酶是pSSB-Y2N端氨苄抗性nmt1肠激酶是pSSB-Y3C端氨苄抗性nmt1肠激酶是人细胞HumanpSSB-H1N端氨苄抗性CMVTEV是pSSB-H2C端氨苄抗性CMV肠激酶是昆虫细胞InsectpSSB-I1N端氨苄抗性PH肠激酶是pSSB-I2C端氨苄抗性PH肠激酶是具体信息详见网站：HYPERLINK。插入基因片段每一个pSSB表达载体设计有多个克隆位点。根据需要

5、，DNA片段可被插入到某一特定的位点。优化表达插入DNA片段的方向和载体的连接确定无误后，下一步将要优化带SSB标签融合蛋白的表达，确定了最佳的蛋白表达水平及相应的生长条件后就可以进行大规模的培养。生长条件应考虑最佳的蛋白表达水平，确定一系列诸如培养基、生长温度、密度、诱导条件等参数。保证足够的通气条件、缩短各个生长时期的时间以及使用正确的抗生素进行筛选都是非常重要的。同时应当确定表达的融合蛋白是在包涵体状态或可溶状态。SSB在一定程度上可以促进目的蛋白的溶解，但有时候会因为过度表达而导致蛋白不能以正确的方式折叠，从而形成包涵体。为降低包涵体的形成，可以适当调整培养基条件来提高重组蛋白的溶解能

6、力，如：生长温度降低至15-30，增加通气，改变诱导条件如降低蛋白表达的速率等。ssDNA-cellulosessDNA-cellulose由单链DNA（ssDNA）与处理过的cellulose进行偶联所得，大约1gcellulose可以偶联2-3mg的ssDNA。ssDNA可以与SSB特异性结合，且1ml溶胀好的ssDNA-cellulose柱料可以结合1-2mg的带有SSB标签的融合蛋白。此介质是自主设计合成的，具有优良的物理和化学稳定性，操作方便，批次重复性好，是研发的理想选择，具体性能参数如表二所示：表二：ssDNA-cellulose的性能参数特点成本低，操作方便基质纤维素吸附载量1

7、ml吸附1-2mg的SSB融合蛋白介质平均直径100mpH范围3-10保存温度4-8保存条件干燥保存纯化SSB标签蛋白可以通过亲和层析柱（ssDNA-cellulose）比较方便的从细胞裂解物中纯化。纯化时，标签蛋白与配体结合，杂质通过结合缓冲液被洗脱去除，之后标签蛋白在温和、非变性的条件下被洗脱下来，可以使蛋白的抗原性能和功能得以保护。如果需要将SSB标签从目的蛋白上切除，标签蛋白可以在与ssDNA-cellulose结合时使用合适的位点特异性蛋白酶酶切，也可在洗脱之后再酶切，在标签蛋白与介质结合时酶切可以节省分离SSB标签与目的蛋白的步骤，因为这样在洗脱目的蛋白时SSB标签仍旧结合在介质上

8、。操作说明缓冲液配制：TE：10mMTris-HCl（pH=8.0），1mMEDTA;结合缓冲液：50mMTris-HCl(pH=8.0),100mMNaCl或100mMKCl,5mMEDTA,2mMDTT,10%glycerol。（结合缓冲液的盐浓度可以根据要纯化的蛋白性质来调节）操作步骤：1、取适量ssDNA-cellulose干料，用TE缓冲液溶胀约2-4个小时。0.2g干料可溶胀为1ml柱材料。装入层析柱后，用5-10倍的柱体积的TE（pH=8.0）洗涤柱子，将未偶联的多余DNA去除。2、用结合缓冲液平衡柱子5-10个床体积。3、用上述结合缓冲液溶解表达的带有SSB标签融合蛋白的细胞，

9、然后将其超声破碎或者裂解破碎，细胞裂解液高速离心后取其上清，缓慢注入层析柱，如果样品挂柱效率低，可降低流速及重复上样。上样完毕后用平衡缓冲液再洗至基线。4、用5-10个柱床体积的低盐（0.1MNaCl或KCl）缓冲液洗脱杂蛋白。5、然后，梯度性地提高盐浓度，洗脱目的蛋白。柱子再生：如果连续重复纯化同一个蛋白，柱子可以再生：首先用含有1.5M或2M的高盐缓冲液清洗柱子5-10个柱床体积，然后用大量蒸馏水清洗，最后用结合缓冲液重新平衡。如果长时间不用或者是纯化其它蛋白，建议重新使用新的柱材料进行纯化。注意事项：结合缓冲液可以随自己所需的要求进行适当更换，如可以使用PBS等其它buffer，但需注意

10、的是，最好不要加入Mg2+，EDTA的浓度保持在2-5mM左右。层析柱在纯化之前溶胀，时间2-4小时，由于DNA与cellulose是物理偶联，所以不建议长时间溶胀后使用，重复使用次数不要超过三次。应用举例实例1：将Sap1蛋白的基因重组于质粒pSSB-E4中，并对表达的融合蛋白SSB-Sap1进行纯化。在E.coli中表达的SSB融合蛋白，每升细胞培养物可以得到3至30毫克蛋白。不同的目的蛋白，表达起伏较大。下面详细介绍用ssDNA-cellulose纯化融合蛋白SSB-Sap1并用凝血酶对标签蛋白进行切割。Sap1在裂殖酵母中大量存在，分子量为30kDa。通过PCR反应从裂殖酵母基因组DN

11、A中扩增得到Sap1基因的DNA片段，插入到pSSB-E4载体的BamHI和HindIII位点。通过筛选获得的编码融合蛋白6His-SSB-Sap1的重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)pLysS细胞中，次日，挑取单菌落接到50ml含有50g/ml卡那霉素LB培养基中培养过夜。过夜的菌液以1:100的比例接到新鲜的培养基中，在37培养至OD600为0.5左右，加IPTG到0.1mM的终浓度，继续37培养诱导3.5h，然后离心收集细胞，用含有0.4MNaCl的结合缓冲液（50mMTris-HCl(pH=8.0),5mMEDTA,2mMDTT,10%glycerol）悬浮菌体，超声破碎细胞

12、，37000g离心30分钟。全细胞提取物，以及随后的细胞裂解液的沉淀和上清用SDS检测，图一表明：6His-SSB-Sap1融合蛋白可溶性高，离心后约90%以上在上清中。由于Sap1蛋白对盐浓度较为敏感，所以我们选择先高盐得到可溶性蛋白后，将其稀释到100mM的盐浓度，高速离心后取上清再对其进行层析纯化。Figure1:Theoverexpressionofthefusionproteins6His-SSB-Sap1inE.coliBL21(DE3)plyscells.用50mMTris-HCl(pH=8.0)，5mMEDTA,2mMDTT,10%glycerol将6His-SSB-Sap1的

13、盐浓度调到0.1M，再进行ssDNA-cellulose层析：层析柱先用TE清洗5-10个柱床体积以去除未偶联的DNA，后用结合缓冲液平衡5-10个柱床体积。用注射器或蠕动泵加入已处理好的样品，为了获得最好的结果，上样时可以调低流速或者重复上样。用结合缓冲液至少洗涤5-10个柱床体积，直到吸收达到平稳的基线或在流出物中没有物质流出。低盐缓冲液50mMTris-HCl(pH=8.0)，0.2MNaCl，5mMEDTA,2mMDTT,10%glycerol洗涤柱子3-4个柱床体积以进一步去除非特异性结合的杂蛋白。用高盐缓冲液50mMTris-HCl(pH=8.0)，0.4MNaCl，5mMEDTA

14、,2mMDTT,10%glycerol洗脱目的蛋白，分管收集。纯化结果如图二所示，根据密度测定法，6His-SSB-Sap1的纯度可达到96%左右。Figure2:Thepurificationof6His-SSB-Sap1inE.colicellextractwithssDNA-celluloseaffinitychromatography.取100g6His-SSB-Sap1加入1单位的凝血酶在0.1MNaCl，2.5MCaCl2，50mMTris-HCl(pH=8.0)，5mMEDTA,2mMDTT，10%glycerol中室温温育2到5个小时，如图三所示，6His-SSB-Sap1融合

15、蛋白被凝血酶充分酶解，6His-SSB可以进一步通过镍-琼脂糖层析除去。Figure3:Removalof6His-SSBtagbyNi2+-NTAAgarosecolumnafterthrombindigestion.实例2：将cds1基因重组入质粒pSSB-Y2中，并对表达的融合蛋白SSB-Cds1进行纯化在酵母中表达的蛋白，一般表达量都很少，目的蛋白占总蛋白的量比例在1%左右甚至更低，只有用western-bloting才能检测出来，但是，酵母中表达的蛋白质一般不会形成包涵体，所以也是蛋白表达较好的一种宿主菌株。Cds1基因全长1383bp，编码460aa，是一个DNA复制过程中细胞周期

16、检验点中关键的蛋白激酶。将cds1的DNA片段插入到pSSB-Y2中的Not和Bgl的两个酶切位点之间，通过筛选获得编码融合蛋白6His-SSB-Cds1的质粒，通过电转化的方法转入酵母细胞LD330，在含有5g/ml的维生素B1与不含有uracil的培养基EMM平板上32生长，约三四天后，将平板上适量的菌转入50ml含有5g/ml的维生素B1的EMM液体培养基中培养，当菌体长到一定浓度后，收集菌体并用灭菌水洗菌体2-3次后，将培养基中的维生素B1去除干净，最后将其换至新鲜的不含有维生素B1的EMM培养基中诱导表达，12.5h后收集菌体并进行蛋白纯化。用1.2MSorbital将菌体悬起，加入

17、10mM的DTT及适量的lyticase在30消化细胞，待90%的细胞在1%TritonX-100中为ghostcell时，立即加入buffer1（50mMTris-HCl(pH=8.0)，0.1MNaCl，5mMEDTA,2mMDTT,10%glycerol），同时加入蛋白酶抑制剂和终浓度为1%的TritonX-100，上下剧烈震荡几次后高速离心（15000rpm，4），得到的上清用ssDNA-celllulose柱子进行纯化。层析柱先用TE清洗5-10个柱床体积以去除未偶联的DNA，后用buffer1平衡5-10个柱床体积。用注射器或蠕动泵加入已处理好的样品，为了获得最好的结果，上样时可以

18、调低流速或者重复上样。用buffer1至少洗涤5-10个柱床体积，直到吸收达到平稳的基线或在流出物中没有物质流出。通过逐渐增加buffer1中的盐离子浓度达到纯化SSB-Cds1的目的.纯化结果如图所示，我们得到了可以考染可见的SSB-Cds1样品，且纯度在70%以上。Figure4：ThepurificationofSSB-Cds1expressedinyeastcellextractwithssDNA-celluloseaffinitychromatography.纯化方法的问题解决表三：纯化方法的问题解决问题可能原因解决方法SSB标签蛋白不结合柱子或者结合非常弱目的蛋白可能改变了SSB的构象或影响了SSB与ssDNA的结合，因此降低了SSB标签蛋白的结合能力。当目的蛋白是非常大的时候，可能会碰到这个情况。降低样品上柱时的盐浓度或改变SSB融合到目的蛋白的N端或C端。平衡时间太短