动物免疫学实验技术-玫瑰花环技术

1、PAGE PAGE 7 第十九章 玫瑰花环试验技术（Rosette formation test technique）一、E玫瑰花环试验基本原理 玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体，所以不能形成E玫瑰花环，以资鉴别。（二）材料与试剂1肝素抗凝剂2淋巴细胞分层液 配制方法见细胞分离技术。3无Ca2+、Mg2+ Hanks液 NaCl 4.00g NaHCO3 0.175g

2、 KCl 0.20g Na2HPO4.12H2O 0.076g KH2PO4 0.030g 葡萄糖 0.50g H2O加至 500.00ml用5.6NaHCO3调pH至7.2，11515min灭菌。4贮藏备用。45.6NaHCO3液 NaHCO3 5.60g H2O 100.00ml 11520min灭菌, 4贮藏备用。50.8戊二醛溶液 25戊二醛溶液 0.32ml Hanks液 9.68ml 用前配制。6Giemsaweight染色液 Giemsa粉 0.03g Weight粉 0.30g 甲醇 100.00ml先将染料一起放入研钵内，加入少量甲醇，研磨细，然后倒入瓶内，并用甲醇冲洗研钵内

3、染料，一起倒入玻瓶内，补足甲醇量，备用。（三）操作方法1取肝素抗凝血2ml，置37水浴自然沉淀30min40min，吸取全部血浆（约1ml）。2于血浆中加Hanks液数毫升，洗涤，1 500r/min离心5min10min，弃上清。重复洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。3采绵羊肝素抗凝血，加数倍Hanks液，洗涤3次，最后以Hanks配成10悬液，4保存。4取0.1ml淋巴细胞悬液，加10红血球悬液0.1ml，加小牛血清0.1ml。537水浴10min，低速离心（600r/min）5min。6吸弃多余的上清液后，放入4冰箱2h4h。7取出后，将沉淀轻轻摇起，加0.8戊二醛0.1ml，混匀后4

4、固定15min。8将干净的玻片用Hanks液沾湿，滴一小滴混悬液，让其自然散开即可。9自然干燥后，用姬姆萨瑞氏液（Giomsaweight）或苏木精伊红染色，水洗，干燥镜检。（四）结果判定凡一个淋巴细胞结合3个或3个以上的红细胞者为一个E玫瑰环。检查200个淋巴细胞，按下列公式计算其玫瑰花环形成率。附：某些动物的E玫瑰花环率马： 38.002.00（29.0151.35） （Tarr,M.J.） 31.209.64（18.7051.29） （成都军区军马防治检验所） 34.804.16（豚鼠RBC） （哈兽研） 30.704.30（绵羊RBC） （哈兽研） 36.5312.09（豚鼠RBC）

5、（东北农业大学）骡： 27.505.46（1438） （成都军区军马防治检验所）驴： 32.903.60 （哈兽研） 42.903.78 （哈兽研）牛： 37.704.20 （Binns） 45.304.00 （James）绵羊：30.702.00 （Binns）山羊：13.301.20 （Binns）猪： 54.101.90 （Binns） 40.8012.86 （东北农业大学）犬： 32.40 （Bowles）猫： 38.00 （Mackey）豚鼠：30.00 （Miguel）人： 34.806.00 （上海第一医学院）（五）注意事项1影响E玫瑰花环试验最主要的因素淋巴细胞和红细胞的新鲜程

6、度，被检血样必须新鲜，无菌，采血后要求在3h4h内进行检验，否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。红细胞用阿氏液保存最多不要超过3周，且不应溶血。2控制好反应温度、时间等条件对玫瑰花环形成率有较大影响。选37作用10min，低速离心5min，置4 2h4h，其结果稳定性较好，结合率较高。如在37作用时间较长，可见玫瑰花环发生变形，结合部位松弛、拉开，甚至解离。3指示红血球的动物种类也与玫瑰花环的形成率有关。如马淋巴细胞与豚鼠红细胞结合较好，而驴则与绵羊红血球结合较好。Melinda氏报道，人、马、牛、猪、狗、猫、鼠与豚鼠红细胞的结合率都高于绵羊红细胞的结合率。4加犊牛血清能增加玫瑰花

7、环形成细胞的稳定性，增强与指示红细胞结合的牢固性。5Hanks液的pH以7.27.4为宜。二、EAC玫瑰花环试验原理 B淋巴细胞表面具有补体C3受体，红细胞可与相应的抗体（溶血素）结合形成抗原抗体复合物（EA），以红细胞作为指示细胞，通过补体传统途径活化补体，而产生活化的C3，然后与活化的C3结合形成花环，以供计数B淋巴细胞。（二）材料与试剂1鸡红细胞悬液的制备 由于绵羊红细胞易与T淋巴细胞形成E玫瑰花环，易造成混淆，所以一般在检测B淋巴细胞时，采用鸡红细胞。从鸡翼下静脉采血，用肝素抗凝，以Hanks洗涤2次备用。2抗鸡红细胞抗体的制备 选2kg3kg的健康家兔，以Hanks液洗过的压积红细胞

8、进行免疫，每日背部皮下注射1次，共注5次，注射量为0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5ml。第六次改用静脉注射50压积红细胞悬液1ml，一日一次，连注3天。末次注射后7天试血，测定红细胞的凝集效价（见表18-1），以出现“+”的最高抗血清稀释度判定为血凝效价。效价达1：2 000以上者为合格。应用时采用凝集价的12（亚凝集价）作为抗血清的稀释度（即1：4 000）。表181溶血素的效价测定 试验组对照组管号12345678溶血素稀释倍数 1010210321033103410351031 红细胞量（ml）0.10.10.10.10.10.10.1溶血素量（ml）0.1

9、0.10.10.10.10.10.10.10.9盐水（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.1混匀，37感作1h结果判定+ +-3补体 当日采集豚鼠混合血清，用Hanks液稀释成1100，置4保存备用。4无Ca2+、Mg2+ pH7.2的Hanks液5姬姆萨染液61戊二醛溶液（三）操作方法1分离淋巴细胞，制成约2.5106个ml悬液。2EAC悬液的制备 取4鸡红细胞2ml于试管中，加入14 000的鸡溶血素2ml，混匀，置37水浴15min，取出后离心，用Hanks液洗涤2次，再用Hanks液恢复至4红细胞2ml，加入等量的1100稀释补体，混匀，再放置37水浴15min取出，用

10、Hanks液洗涤2次，配成4EAC细胞悬液。3取淋巴细胞悬液0.2ml，加入4EAC细胞悬液0.2ml，混匀，室温或20作用30min。1 000r/min离心5min，吸弃过多的上清液，放入42h4h。4取出后，将沉淀轻轻摇起，加1戊二醛0.1ml，混匀后置4固定30min。5以悬液制片，自然干燥，滴加姬姆萨液染2min，加自来水继续放置15min，冲洗，将玻片置95酒精缸脱色15sec30sec（以脱成浅紫蓝色为度），再置盐酸液缸（按1HCl 1份与自来水2份）脱色（呈淡兰略带红色为度）10sec左右，取出冲洗，干后镜检。（四）结果判定 凡一个淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞即为EAC花环形成

11、阳性细胞。共计数200个淋巴细胞，计算花环形成率。（五）注意事项1加入淋巴细胞与鸡红细胞的比例一般以140为宜（130150），淋巴细胞过少，花环形成率明显减少。2淋巴细胞、红细胞、补体均应新鲜，否则花环形成率明显下降。3据认为小鼠补体比豚鼠补体更为好，小鼠血清中胶固素活化因子（KAF）含量较多，可使大部分C3裂解而不易引起溶血。三、EA玫瑰花环试验原理 B淋巴细胞有表面Fc受体，以鸡红细胞作为指示细胞与相应的抗红细胞抗体形成EA，B淋巴细胞可以通过Fc受体与EA形成花环，以此计算B淋巴细胞的数目。Fc受体并非B细胞所特有，中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞表面均有这种受体，但这些细胞可以通过形态

12、学加以区别。此方法简单，目前较常采用，以检测B淋巴细胞的百分率。材料与试剂 基本同EAC花环试验，只是不需要补体。（三）操作方法1EA悬液的制备 取4鸡红细胞悬液2ml加入试管中，再加等量的14 000稀释的溶血素，混匀，置37水浴中15min，以Hanks液洗涤2次，再以2mlHanks液悬浮，为EA悬液。2取淋巴细胞悬液0.2ml于试管中，加入等量的4的EA悬液，混匀，室温或20作用30min，1000r/min离心5min，吸弃过多的上清液，置4 2h4h。3固定，制片，染色同EAC花环形成试验。4结果判定 同EAC花环形成试验。四、混合型玫瑰花环试验原理 混合型玫瑰花环的方法是既应用补

13、体致敏的家鸽红细胞（PRBC）作为B细胞的标志，同时又应用绵羊红细胞（SRBC）作为T细胞的标志，在一张玻片上同时检测T、B淋巴细胞。材料与试剂 参见E、EA、EAC玫瑰花环试验。（三）操作方法1鸽翼下静脉采血，加等量阿氏液，保存于4，可用2周。2以Hanks液洗鸽红细胞3次，最后配成5PRBC悬液。3取5PRBC0.25ml，加溶血素（兔抗鸽红细胞抗体，亚凝集单位）0.25ml于37水浴30min。以Hanks液洗涤3次，去上清，加Hanks液0.25ml。4加1SRBC悬液0.25ml，37水浴30min，Hanks液洗涤3次，去上清，加Hanks液0.25ml。5加淋巴细胞悬液0.25ml（21064106个细胞ml），37水浴5min，500r/min离心3min，置4过夜。6取出迅速加入20甲醛溶液0.5ml，混匀，于4放置10min后，加2滴2美兰液，轻轻摇匀。7取1滴于载玻片，加盖玻片，置镜下观察。计数300个淋巴细胞。（四）结果