免疫检测技术基本原理

1、第三节免疫检测技术的基本原理抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原将免疫反应与现代测试技术结合超微量的检测1Pg/g1门g/g1Rg/g1mg/gIIII1Pg/g1门g/g1Rg/g1mg/gIIIII放射免疫测定法/酶免疫测定法色质联用分析I放射受体分析气相色谱(ECD/NPD)气相色i普(FID)高讽浪fimf(FLD/UVD)极谱法荧尤分光光度法|微生物测定法襟夕卜/叮见分光拓忒图1各种测定方法的灵敏范围免疫学检测技术的优点高度的灵敏性高度的特异性免疫分析技术的应用常用的诊断技术血凝试验酶联免疫吸附试验胶体金免疫技术放射免疫分析技术凝集试验71

2、A概念：颗粒性抗原（细菌.红细胞等）与相应抗体结合,在一定条件下出现肉眼可见的凝集物,称为凝集反应。直接凝集反应A抗原与抗体直接混合作用,出现凝集为阳性结果。玻片直接凝集法：定性试验A试管直接凝集法:半走量试验玻片直接凝集试验廿+试管法半定量试验ZIS二9SZ二8Z17I寸9二ZE二91二Q二寸二Z二eeeee2间接凝集法先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上（如RBC,乳胶颗粒）f再与相应抗体或抗原反应f出现凝集为阳性结果。临床常用的有间接血凝试验乳胶凝集试验等。间接凝集抑制试验先将待检抗原与已知的抗体反应,再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。凝集反应）CO1+丄Y人卜可涯性

3、抗应咬顾杜抗徉航廉问妊纹*23示ACHB丫（百+）+一A抗体可徐性抗原玫*ta濒攥抑制颅JMt*卯個九豪*反成示J-5c&goOcex】5加酶标抗体6洗涤清稀释度62248137加底物显色&观察结果Iz0O-OJ641282565121024阳性对照阴性对網包被固相载体：用已知抗原包被固相载体加底物显色未结合的酶标抗抗体加待检标本：使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体：与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定AddAg-Ab)toantigen-coatedwellAddesizyme-cofijugatedsecoriilaT

4、yAddsubstraterrooalor（三）竞争法CompetitiveELISAIncubateantibodywishahliffefiantibody此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体O用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合加底物显色分别洗涤除去未结合的成分V丿分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比,计算标本中待测抗原含量对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深;测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多

5、，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。ELISA在饲料安全检测中的应用彎饲料中盐酸克伦特罗的测定矚饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素,简曲霉毒素）礒饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏ELISA用于农药残留的检测蹑甲胺磷残留分析螺甲基对硫磷残留分析翅咲喃丹残留分析农药的检测:主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。植物毒素如罂粟殓.吗啡、藻类毒素食源性病原菌检测试剂盒大肠杆菌检测沙门氏菌检测单增李斯特菌金黄色葡

6、萄球菌食品其他检测:转基因成份的检测：如转基因玉米中中的cry9e蛋白i转基因大豆中的CP4EPSPS蛋白质.II1肉制品的掺假检测：:以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋Ai抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在:掺假率为1%时即可检出荧光抗体技术的原理与方法用荧光素标记抗原或抗体,再与标本中抗体或抗原反应,然后在荧光显微镜下观察,形成的IC可散发出荧光,对标本中的抗原或抗体逬行测定和定位。常用的荧光素A异硫鼠酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)等。常用的方法直接荧光法间接荧光法荧光标记抗体荧光标记抗体直接法k间接法抗体洗补体法

7、抗体人涤涤补体X荧光标记.抗C3抗体；g涤免疫荧光技术一直接法免疫荧光技术一直接法荧光素标记的特异性抗体组织切片免疫荧光技术间接法免疫荧光技术间接法荧光素标记的抗抗体组织切片免疫荧光技术卄伴*抗体旅体Xs?AA诜1%诜.4吳尢标昶员免皮球姜休o如补体nn诜雄如吳北标讫扶XJ3妊休7丄，zCjz玉5冼亍九浚奂尢执丰12fThisstate-of-the-artmicroscopecontainifiaccessoriesforQIC,flooredcnce,polarizedlight,phasecontrast,andphotomicrographyusingseveralfilmformat

8、sanddigitalimagecaptureTheOlympusProvisAX-70(circa1998)荧光显微镜使用原理A4FWXX、sxx、激发滤片(BG)标本吸收滤片(OG)FITC吸收光峰值：490-495nmFITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这_反应也可以通过银颗粒的沉积

9、被放大,称之为免疫金银染色(immunogoldsilverstaining,IGSS)。胶体金(colloidalgold)的制备一般采用还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、蹂酸、抗坏血酸白磷.硼氢化钠等。向一走浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子,形成金颗粒悬液,也称金溶胶(goldsolution)。耐金的制备及肆胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性(nm)(ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙红色522411.00红色52571.50.70紫色535決还原100ml0.01%HAuCI4所需量胶体金(CoJZdnJSuJsJ)优质劣质Fig

10、ureI-GoodqualitygoldparticlesFigure2-Poorqualitygpldparticles瞬錨會物（豆）Adsorptionofproteinstogoldcolloid免疫渗滤测是(IFA)斑点渗漏法其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗僚，冠滴加金棕身一株童抗，若宥抗原则形成金-Ab-Ag薄膜的红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2薄膜的质控点，是为金标二步法。IFA-一双BB夹心遽测牖Awpositivetest-ilfa结弟判断阳性阴性测定无效二免疫层析测定（ICACros

11、ssectionnegativetest30r层析法将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形成Ag-Ab金复合物，当上行至中段醋酸纤维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单扰上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控的提示。d匕种方法彳尔金*示一步法。兔抗鼠IgG斑点金免疫层析试验（一）=手持端鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗=尿液浸湿标志线斑点金免疫层析试验（二）质控线测试线尿样ICA双抗体夹心法测晰ICA-竞争法测抗原C3-T免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图ICA寛争

12、法结果灘阴性阳性无效ICA间接法测抗体ICA结果观察阳性阴性无效IFA与ICA的妣IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存48工6个月室温一年操作步骤351观察时间3min320min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深IFA穿流(FLOWTHROUGHICA横流(LATERALFLOW)001、罗立新，缪珑，潘力，等快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究J中国卫生检验杂志，2006,16(2):154-156.2、赖卫华，熊勇华，陈高明，等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究J食品科学,2005,26(5):204-207.3、i甚志强，段惠莉，王新为，等.

13、大肠埃希菌0157:H7的胶体金免疫渗滤法检测J中国公共卫生，2005,21(4):705-706.4、谢昭聪，宋志强，吕敬章,等.应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究J中国国境卫生检疫杂志，2005,28(3):163-165.5、王中民，李君文/王新为/等.免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌的研究J.微生物学免疫学进展，2001,29(4):45-47.6、刘永德，汪毅，陈禹雷，免疫金探针快速检测禽流感病毒研究J上海交通大学学报：农业科学版，2005,23(3):321-324.斑点金免疫渗滤试验AoBo加尿样除去滤器加胶体金标记抗体加洗涤液950684512KD1204124KD

14、950684512KD1204124KD免疫印迹法图解SDS裂解0病毒聚丙酰胺凝胶电泳第四节放射性核素标记技术、常用标记方法八标记免疫物的分离与纯化eR:放射性核素示踪咼灵敏-不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信号（标记物的放大效应）L免疫学反应高特异=废除以往沿用的无机或有机试剂，代之以抗体为结合剂常用标记方法1、常用放射性核素2、1251的标记方法直接法（氯胺T法）间接法（连接法）直接法（氯胺T法）-NHCHONH-bH氯胺TNa125I4。C-NHCHONH-CH2bHOH间接法（连接法）OHIVNSHPP+Na125Ich2OIIH-C-C-O-N-C-CH.IIII-HOO=C-

15、C-CH0氯胺TICH?O|-IIH-C-C-O-N-C-CHIIIIHOO=CCCHOHX/i25iVIch2IIIIHOO=C-C-CH2间接法（连接法）+NH?-蛋白质OIIH-C-C-O-N-C-CH.OHOH人肿1CH.I-h-c-c-n-蛋白质IIIIHOH标记免疫物的分离与鉴定1、分离目的：去除游离放射性核素方法：柱层析2、鉴定游离放射性核素含量免疫活性比放射性（mCi/mg）AA+earOOOO结合相游离相O夕O&O含放射免疫分析法的原理与方法B液闪仪Y计数器化学发光标记免疫技术直接化学发光酶促化学发光特点电化学发光特点标记免疫分析三方式与四环节三个方式A、直接法B、间接法C、夹心法四环节为:1抗体生产2、标记试剂制备3、分