高二生物选修四基因工程课件

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子编码区编码区： 能转录，编码蛋白质能转录，编码蛋白质非编码区：非编码区： 不编码蛋白质不编码蛋白质, ,能调控遗传信息表达能调控遗传信息表达真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子内含子 外显子外显子 与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合

2、位点编码区编码区：非编码区：非编码区：外显子：外显子： 内含子：内含子： 能编码蛋白质的序列能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子启动子启动子原原核核真真核核基因的结构基因的结构原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 目的基因主要是指目的基因主要是指

3、_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来目前被广泛提取使目前被广泛提取使用的目的基因有：苏用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因植物抗病基因人胰岛人胰岛素基因等。也可以是素基因等。也可以是一些具有调控作用的一些具有调控作用的因子因子l 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因1.1.什么是基因文库？什么是基因文库？2.2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所

4、需的目的基因？种类：种类：基因组文库：基因组文库：部分基因文库：部分基因文库：( (如如cDNAcDNA文库文库) )基因的核苷酸序列等基因的核苷酸序列等含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因含有一种生物的含有一种生物的部分部分基因基因根据基因的有关信息：如基因的转录产物根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNAmRNA2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分

5、离分离( (直接分离法直接分离法) )( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(cDNA)该生物该生物cDNA文库文库1 1、 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 通过这项技术可在通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外

6、体外DNADNA扩增技术。扩增技术。聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段2 2、原理：、原理： DNADNA复制复制（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP) 一对引物一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需需含有目的基因含有目的基因 ) ) 一对寡核苷酸序列：与目的基因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物根据这一序列合成引物温度控

7、制温度控制PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成_ _ b b、复性（、复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下，从引物的用下，从引物的_延伸，合成与延伸，合成与模板互补的模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链5端端3端端DNA合成仪合成仪推推

8、测测推推测测合合成成1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _。 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一

9、个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程: : 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，

10、结果成长的植株，有了抗虫能力。 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA

11、聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体

12、基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： （二）方法

13、（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单

14、子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。过程：过程：优点优点（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法

15、：方法： 用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基

16、因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:归纳步骤DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515