核盘菌病毒dsRNA提取方法

1、湖南农业大学生物化学与分子生物学实验技术课程实验设计书实验项目名称：核盘菌病毒dsRNA提取方法学 生 信 息：姓名 班级 生安一班 学号 指导老师姓名：。学生所在学院：植物保护学院联 系 电 话：生物化学与分子生物学实验技术课程组二一 三 年 五 月制核盘菌病毒dsRNA提取方法前 言1-5主要包括：(1)为什么要写这篇实验设计,要解决什么问题；(2)本设计在学科领域中所占的地位,有什么意义和价值；(3)本设计所涉及的界限、规模和范围；(4)理论依据和实验设备基础；(5)预期目标；(6)概念和术语的定义。核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(ib.)de Bary)是一种

2、重要的植物病原真菌，在我国常年严重为害油菜、向日葵和大豆等油料作物及多种蔬菜作物。由于该菌在病残体上形成的菌核可以在土壤中顽固存活，给防治带来了极大的困难。目前核盘菌引致的作物(包括蔬菜)菌核病仍然依赖于化学农药防治，化学农药防治在一定程度上可确保作物的产量，但也造成了严重的后果，其主要有两个方面:(1)由于长期大量使用农药，核盘菌群体中已出现了抗药性菌株;(2)农药给环境(空气、水和土壤)造成了严重的污染，特别是直接污染了食品(食用油和蔬菜等)。考虑到农业持续性发展的要求，环境问题的紧迫性及食品卫生等诸多因素，降低化学农药使用剂量和频次势在必行。利用抗病品种和生物防治是替代化学农药防治菌核病

3、的最佳途径。但目前这两种措施均没有取得突破性进展，其主要原因是对核盘菌的认识不够。深入了解核盘菌的致病机理及病菌致病力(毒力)衰退的机理将为菌核病的防治研究提供新的思路和线索。真菌在生命之树上占据了极其重要的地位，其多样性及进化地位已获得充分认识肯定（刘慧泉，2011)。真菌病毒是一类能感染真菌并且能在真菌中有效复制的病毒，虽被证实广泛存在于各类真菌中，与动物病毒和植物病毒相比而言，研究却相当滞后，与分布广泛的真菌类群形成鲜明对比。目前关于真菌病毒分布及寄主范围的研究报道很少，基因组已被测序和报道的真菌病毒就更加少之又少，究其原因，主要是由于大部分已知的真菌病毒对寄主真菌造成的表型影响非常微小

4、，难以被发现，不容易引起研究者的注意；另一方面，伴随着弱毒菌株现象的发现，真菌病毒学者开始对能够导致植物病原真菌致病力降低的真菌病毒产生兴趣，对此类病毒的研究投入了极大的精力，以期将其开发成能对抗真菌病害的生防制剂，或作为研究工具来探究真菌宿主的生理机制（Ghabrial et al, 2009b; Pearson et al, 2009)。有关真菌病毒的首次报道是在1962年，英国科学家Hollings等在双孢蘑燕里发现了三种真菌病毒粒体。此后从许多真菌中先后发现了多种病毒存在，据估计至少有30%的真菌中携带有病毒，说明真菌病毒的分布较广泛（Lemke, 1979; Buck,1986)。到

5、目前为止，所发现的绝大多数真菌病毒粒子是球形的，除此之外还有线状、棒状、杆状、有囊膜的杆状以及疱疫病毒等形状存在（Pearson e/a/., 2009)。真菌病毒基因组核酸大多是dsRNA或( + )ssRNA，其巾以dsRNA为主(Buck, 1986)，于晓等在2010年首次报道了真菌巾存在ssDNA真菌病毒。真菌病毒分布广泛，几乎存在于所有的真菌中，但关于病毒分类的研究却还处于起步阶段，根据基因组片段数目，目前所发现的dsRNA真菌病毒可分为以下四大类：Reoviridae (呼肠孤病毒科)、Totiviridae (单分病毒科)、Chyroviridae (产黄青霉病毒科）和Pari

6、rsviridae(双分病毒科），而ssRNA病毒可分为Hypoviridae (弱毒病毒科）、Namavirida(裸露病毒科）和杆菌状核糖核酸病毒科（Bamaviridae)。近期在植物上发现了 单分体dsRNA病毒，进化上介于单分病毒科病毒和双分病毒科病毒之间（Martinet al.，2011; Sabanadzovic et al, 2009)；在白纹羽病菌巾发现了一种大型的双分体dsRNA病毒，与单分病毒科和产黄青霉科成员的亲缘关系较近，这都证明了部分真菌病毒与植物病毒具有一定的同源性。真菌病毒核酸序列已测定的还很少而针对真菌病毒基因组相关分子生物学特性的广泛研究，病毒的核酸序列也

7、成了真菌病毒分类的重要依据之一（Hong e? a/., 1999)。目前还有部分真菌病毒的分类地位未确定，因此，发现新的真菌病毒并测定其核酸序列，对真菌病毒的研究非常重要大多数的真菌均被证实里面含有病毒，而对真菌病毒传染性检测的缺乏，使得由病毒引起的表型变化难以确定，目前，仅有部分病毒已被证明确凿导致一个特定的表型。真菌病毒无处不在，但缺乏使寄主表型明显变化的效果，导致数研究者认为真菌病毒，真菌生物学没有发挥作用。但我们目前研究的真菌病毒数量有限，因此，如果仅凭所得到的一些数据而做出对所有病毒的假设是很容易出现错误的，只有尽量多的研究不同的真菌病毒，才能得到更详尽更准确的结论。随着分子生物学

8、的迅速发展，许多生物化学及分子生物学技术被应用于植物病毒的诊断鉴定，给病毒分类鉴定提供了丰富可靠的依据。1979年Motris和Dodds从感染RNA病毒的植物和真菌组织内提取了病毒dsRNA。这些dsRNA完全对应于RNA病毒基因组信息，并且理化性质稳定，对酶具有一定的抗性，而正常植物中一般不存在大分子dsRNA。该方法可以用来检测植物RNA病毒。在病毒研究的过程中,病毒的提取质量是病毒检测和基因组克隆的关键。因为dsRNA的特殊性。目前尚未像总DNA和总RNA提取有现成的试剂盒或快速简便的提取方法。提取技术是利用纤维素能在一定的酒精浓度下特异吸附的原理而发展起来的。目前的dsRNA分析法还

9、不完善，没有一套公认的特别有效的抽提方法，有待于研究与实践。一、实验目的 掌握提取实验技术，实现对病毒的检测、鉴定等实验目标或应用。二、实验原理 DoublestrandedRNA(dsRNA)是RNA病毒复制过程的中间产物，这些dsRNA的大小对应于RNA病毒的基因组，而正常的植物或真菌组织不含有或仅产生小分子量的dsRNA，RNA病毒复制过程会产生长度与基因组RNA相似的dsRNA，某些dsRNA病毒的子代基因组也是dsRNA，并且这些dsRNA相对于ssRNA稳定得多。dsRNA分析方法是利用CF一11纤维素能在一定的酒精浓度下特异吸附dsRNA的原理而发展起来的。因此可通过提取dsRN

10、A对该类病毒进行检测、鉴定等方面的研究。3、 实验流程图6四、主要实验仪器设备（设备注明厂家型号，器皿耗材标明规格）低温高速离心机(离心机型号：TG18G，凯达集团), 电泳仪(JY600D通用型电泳仪), 涡震仪(型号VM-10).五、实验材料及试剂6（含材料的预处理和试剂的配制方法等）化学试剂CF-11(Sigma)，SDS（上海生工生物工程技术服务有限公司），酚-氯仿-异戊醇混合液(酚：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1,上海生工生物工程技术服务有限公司).其他试剂均购自北京天根生物有限公司10×STE NaCl 58.50g Tris-Cl(1mol/L,pH8.0) 10

11、0.0ml EDTA(0.5mol/L,pH8.0) 20.00ml 定容至1000ml，高压灭菌。10SDS SDS 10.00g 加热至68溶解，定容至100ml，pH7.2。TE缓冲液 Tris-Cl(1mol/L,pH8.0) 5.0ml EDTA(0.5mol/L,pH8.0) 1.00ml 定容至500ml，高压灭菌。样品：经过摇瓶培养后的核盘菌，用灭菌的纱布过滤并用滤纸吸干水分备用六、实验操作步骤6-101.称取.克菌核组织，在液氮中充分研磨至粉末状;2.加入500L，2倍体积的STE（PH为8.0）、500L酚-氯仿-异戊醇混合液、50L体积分数为10%SDS和15L -巯基乙

12、醇，涡旋3min，加入试剂量随生物组织量而定。3.在4下12000r/min离心3min，收集上清液，用无水乙醇将其浓度调至17%，并加入6080纤维素，涡旋混匀;4.在4下10000r/min离心3min。5.弃上清，加1ml含17%乙醇的1xSTE，涡旋混匀;6.10000g，离心5min，弃上清;7.重复5、6步骤2次;8.加0.3ml 1xSTE，涡旋混匀，10000g，离心5min，取上清;9.加0.4ml 1xSTE，涡旋混匀，10000g，离心5min，取上清;10.合并两次上清，加等体积预冷的异丙醇，-20下静置1h。11.在4下15000g，离心15min，弃上清;12.用1

13、50L70%的乙醇洗沉淀，15000g，离心3min;13.用200L70%乙醇洗沉淀，真空干燥3min:14沉淀及时溶解于30LTE中，一20保存;15.取5L在琼脂糖凝胶上进行电泳分析。根据凝胶电泳所显示的dsRNA条带的大小，与己知RNA病毒dsRNA或相应DNA分子量Marker进行比较，确定待检测病毒基因组RNA种类和大小。7、 实验方法讨论11-13（本设计采用的实验方法与其他同类方法的比较分析）此项技术有几点优于其它病毒诊断方法之处。在传统的植物病毒诊断中，通常面临寄主成份复杂、病毒或病毒RNA不稳定的难题，dsRNA分析方法克服了这些问题。此项技术简单、相对经济，且获得的dsR

14、NA排除了寄主的干扰，可在相对较短的时间内得到结果。这项技术可以检测其它诊断方法未必检出的复合侵染，而且dsRNA技术主要根据病毒基因组的大小来分辨不同病毒，因此可区分病毒的不同株系，如携带卫星RNA的CMV株系与不携带卫星RNA的CMV株系，也可纯化不稳定病毒的dsRNA。还可根据病毒产生的dsRNA检测新的病毒，纯化的dsRNA可用于分子克隆或制备探针以及抗体。dsRNA技术也存在缺陷，只有RNA病毒可以被检出，并且要求实验者具备不同种属RNA病毒基因组的大小和数量的知识。某些植物含有潜隐病毒或细胞自身产生的大小类似于ssRNA病毒产生的dsRNA;某些病毒如Luteovirus和poty

15、virus，只产生少量的dsRNA，也给诊断工作带来困难。而且有时田间样品和温室接种的植物中dsRNA的含量相对较低。为了快速可靠地诊断病情，RNA病毒的其它检测技术不断得到改进，但dsRNA分析方法还是适用于大多数植物病毒初步筛检，可作为其它技术的补充。8、 注意事项（安全风险，易导致实验出问题的因素，提高成功率的技巧）提取过程中最重要的注意事项是防止酶的污染导致实验失败。笔者总结一下技巧，帮助大家提取更高质量的。一，整个实验过程都要佩戴一次性手套。因为皮肤经常带有的细菌霉菌等微生物及人体自然脱落下来的皮屑，都可能成为酶的来源。使用灭菌的一次性的塑料器皿抽取，避免使用公共仪器，公共仪器或多或

16、少都会含有酶，特别是操作时有时要加入酶，消化样品中所含的。二，操作时勤换手套，冰上操作，戴手套口罩，动作要迅速。最关键的一步也是决定质量的一步是：加氯仿里型年后，出现分层，在上清中，中间的是，下面是蛋白。吸取上清时一定要小心，防止将中间的混入，以免影响的质量。乙醇清洗后，一定要完全除去乙醇（至无乙醇味），否则会影响电泳上样。异丙醇沉淀以上。在这过程中有一个小技巧，就是再加入氯仿离心后，一般上清液的量约占总体积的。为了提高的质量和产率，离心后并不马上吸取含有的上清液，而是移取中层的和下层的蛋白。余下的下层油相，经短暂高速离心后在吸取上清中含有的水相。因为当下层油相占很少体积时，上下层的界面所占的

17、体积少，不会浪费太多的水相，吸取中间蛋白相和下层油相的可能性也小。其实这技巧可用于所用的分层液相的实验，如酚抽提的实验，回收胶中的实验。参考文献:1 冯 焱，何 建，聂振朋，等.RT-PCR技术及其在马铃薯病毒检测中的应用J . 南方农业，2007,1(6):-2 李 贺，代红艳，张志宏，等.草莓植株中病毒 dsRNA 的分离和鉴定J . 中国农业科学, 2006,39(1):145-152.3 姜道宏,核盘菌Ep一IPN菌株毒力衰退及生防潜能的研究D. 华中农业大 教10504) 博士学位论文4 张姝聪,核盘菌菌株JX-A4生物学特性及其真菌病毒研究D. 华中农业大 学硕士学位论文5 杜磊,核盘菌致病力衰退相关病毒SsDRV防治油菜菌核病的研究D. 华中 农业大学硕士学位论文6 陈红,黄瓜花叶病毒dsRNA的研究D.浙江大学生命科学学院硕士学位论 文.7 牛建新,陈 萍,李西平,等.葡萄卷叶病毒 R TPR检测技术研究J .西 北农业学报,2004,13(1):28-32.8 陈开英,梁平彦.我国栗疫病菌体中dsRNA的初步研究J.森林病虫通 讯,1990,(1):23一259 淳俊,郑彦峰,王胜华,等.一种广泛适用的RNA提取方法J.生