共聚焦激光扫描荧光显微镜 简介以及原理PPT教案

1、会计学1共聚焦激光扫描荧光显微镜共聚焦激光扫描荧光显微镜 简介以及原简介以及原理理 什么是什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜？ 共聚焦激光扫描荧光显微镜共聚焦激光扫描荧光显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统微镜系统共聚焦系统 细胞CT 第1页/共31页荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质： 某些物质在特定波长

2、范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线 荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm 520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。漂白(BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光

3、的能力逐渐下降并最终丧失 漂白。第2页/共31页二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 带通滤色镜带通滤色镜( (BP)BP)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合（LP LP + + KPKP）：）：LP450 + KP490LP450 + KP490 双色镜：双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：阻断滤镜：多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；LP490LP490紫外蓝绿高压汞灯

4、被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm 520nmFITC450nm 490nm第3页/共31页荧光显微镜的不足:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度荧光强度不够。6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠7.只能在二维环境下观察。8.样品不能太厚。9.荧光的串绕无法回避。10.放大倍率小。第4页/共31页共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置Laserand

5、 electronicControl Unit激光光源及控制装置Computer计算机Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibration table防震台Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System第5页/共31页第6页/共31页第7页/共31页第8页/共31页第9页/共31页第10页/共31页第11页/共31页第12页/共31页第13页/共31页第14页/共31页第15页/共31页第16页/共31页第17页/共31页第18页/共31页第19页/共31页第20页/共31页第21页/共31页第22页/共31页第23页/共31页光电倍增器双色镜激发和发射滤波滑动器强度调整密度塔激发发射和射柱准直仪电源X-Y检流计镜扫描控制器出入口透镜系统第24页/共31页第25页/共31页第26页/共31页第27页/共31页第28