荧光定量PCR技术2010[1]10生物科学分子生物学

1、qPCRqPCR系统系统“从从RNARNA提取到荧光定量提取到荧光定量PCR”PCR”解决方案解决方案生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室内容概要内容概要1 荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1 荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1 荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1 荧光定量实验流程及注意事项荧光定量实验流程及注意事项1 荧光定量应用及实例荧光定量应用及实例实时定量实时定量PCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一每一个循环扩增产物量的变化个循环扩增产物量的变化，通过，通过Ct值和标准曲线的值和标准曲线的

2、关系对关系对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法无法对起始模板准确定量对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测，无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义荧光定量荧光定量PCR原理原理常用名词概念常用名词概念介绍三个概念：介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过CtCt值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量进行定量分析分析Cycle（循环数）（循环数）R

3、n（荧光强度）（荧光强度）BaselineLogliner phase平台期平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线 2. 荧光定量标准曲线Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLogliner phase1 前前15个循环信号作为荧个循环信号作为荧光本底信号（光本底信号（baseline）1真正的信号真正的信号:荧光信号荧光信号超过域值，进入指数扩增超过域值，进入指数扩增期之后期之后1荧光域值荧光域值的缺省设置是的缺省设置是315个循环的荧光信号的个循环的荧光信号的标准偏差的标准偏差的10倍倍1手动设置：大于荧光背手动设置：

4、大于荧光背景值和阴性对照的荧光最景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初高值；进入指数期的最初阶段阶段Threshold荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光域值荧光域值平台期平台期Ct值的定义：值的定义： PCR扩增过程中，扩增过程中，扩增产物的荧光信扩增产物的荧光信号达到设定的阈值号达到设定的阈值时所经过的时所经过的扩增循扩增循环次数环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值同一个样品重复同一个样品重复9696次次PCRPCR的扩增曲线的扩增曲线 荧光定量荧光定量PCR原理原理PCR vs qPCRCtCt值

5、的特点：值的特点： 相同模板进行相同模板进行9696次扩增，终点处产物量不恒定；次扩增，终点处产物量不恒定； CtCt值则极具重现性值则极具重现性理想的理想的PCR反应反应XnX0 2n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理非理想的非理想的PCR反应反应XnX0 （1En）n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数En：扩增效率：扩增效率荧光定量荧光定量PCR原理原理CtC

6、t值定量的数学原理值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为CtXCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：在阈值设定以后，：在阈值设定以后，XCt是一个常数，可以用荧光强度表示的产物量，定为是一个常数，可以用荧光强度表示的产物量，定为M方程式（方程式（1）两边同取对数得：）两边同取对数得：LogMLogX0 *（1En）Ct （2）整理方程式（整理方程式（2）：）：LogX0 Log M Ct Log（1En）荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理Cycle numberCk 104Ck 102Sa

7、mpleLog of DNA concentration0 起始模板量越多，荧起始模板量越多，荧光达到域值的循环数越少，光达到域值的循环数越少，即即Ct值越小。值越小。0 Log模板起始浓度与模板起始浓度与Ct值呈线性关系。值呈线性关系。荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系q确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 q通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample25线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认标准曲线斜率标准曲线斜率: -3 : -3

8、-3.5-3.535Cycles35Cycles内可得到好的定量结果（科研领域）内可得到好的定量结果（科研领域）如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增35 Cycles35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数（相关系数（R R2 2）：大于）：大于0.980.98荧光定量荧光定量PCR反应有效性的确认反应有效性的确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）:0.9-1.2:0.9-1.2. 定性分析研究：定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等）分析等. 绝

9、对定量研究：绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO定量检测等定量检测等. 相对定量研究：相对定量研究：mRNA表达量分析，表达量分析，siRNA效果确认，基因芯效果确认，基因芯 片结果验证，差异显示结果验证等片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量荧光定量PCR技术的应用技术的应用内容概要内容概要1 荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1 荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1 荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南公司荧光定量产品选择

10、指南非特异性荧光标记非特异性荧光标记 SYBR Green I特异性荧光标记特异性荧光标记 TaqMan Probe分子信标分子信标常用荧光标记方法常用荧光标记方法SYBR Green I染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一种结合于所有是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green I热热 变变 性性引物退火引物退火延伸反应延伸反应SYBR Green I 染料法染料法作用机理作用机理q SYBR Green SYBR Green 能结合到双链能结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位q SYBR

11、Green 只有和双链只有和双链DNA结合后才发荧光结合后才发荧光q 变性时，变性时，DNA双链分开，无荧光双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段发荧光，在此阶段 采集荧光信号。采集荧光信号。SYBR SYBR GreenGreen SYBR Green I 染料法染料法作用机理作用机理Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板模板DNA量越多，荧光量越多，荧光达到域

12、值的循环数越少达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系，根据样品关系，根据样品Ct值，就可值，就可以计算出样品中所含的模板以计算出样品中所含的模板量量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析温度温度荧光强度荧光强度TmTm值：值：DNA解链一半时的温度解链一半时的温度实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSingle

13、 amplified product溶解曲线检测引物特异性溶解曲线检测引物特异性 Melt curve showing two amplified products SYBR Green SYBR Green 法法 -PCR-PCR反应的建立反应的建立反应体系的建立及优化反应体系的建立及优化:SYBR Green 使用浓度使用浓度:太高抑制太高抑制Taq酶活性，太低，酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准量不准MgCl2的浓度的浓度:可以降低到可以降低到1.5mM,以减少非特异性以减少

14、非特异性产物产物反应反应Buffer 体系的优化体系的优化反应温度和时间参数反应温度和时间参数:由酶和引物决定由酶和引物决定1. 其他与常规其他与常规PCR相同相同SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定起始模板的测定q 融解曲线分析：可以优化融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对对DNA模板

15、没有选择性模板没有选择性 -适用于任何适用于任何DNAq 使用方便使用方便 -不必设计复杂探针不必设计复杂探针q 非常灵敏非常灵敏q 便宜便宜优 点q 容易与非特异性双链容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性结合，产生假阳性 但可以通过但可以通过融解曲线的融解曲线的分析分析，优化反应条件，优化反应条件q 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高缺 点问题点：问题点： SYBR Green I与任何双链与任何双链DNA进行结合后散发荧光，因进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检

16、测结果不准确。同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBR Green I染料法染料法问题点与关键点问题点与关键点关键点：关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！设计合适引物，防止非特异性扩增！Taqman探针法探针法原理原理+ 5端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R)+ 3端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)+ 探针完整，探针完整，R发射的荧光能量被发射的荧光能量被Q基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光， R与与Q分开，发荧光分开，发荧光+ Taq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法探针法

17、工作机理工作机理热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应每扩增一条每扩增一条DNA分子，释分子，释放一个荧光信放一个荧光信号，可以在循号，可以在循环过程中任一环过程中任一点检测荧光点检测荧光1、引物、探针的设计原则：、引物、探针的设计原则： 探针探针Tm为为68-70 ，30 bp, 5不能有不能有G，G可能会淬灭荧光可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段素，引物尽量靠近探针，扩增片段200 bp，引物，引物Tm为为59-60 2、反应参数的设定：、反应参数的设定： 一般为：一般为：94 ，10-20S 60， 30-60S（Taq酶酶53外切核酸酶活性在外切

18、核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号值，最大信号/背景比值背景比值 引物浓度：引物浓度：100-900nM 探针浓度：探针浓度：50-300nM4、其他与常规、其他与常规PCR相同相同Taqman探针法探针法PCR体系的建立体系的建立TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性对目标序列的高特异性 -阴性结果确定阴性结果确定q 设计相对简单设计相对简单 -与目标序列某一区与目标序列某一区域互补域互补q 重复性比较好重复性比较好优优 点点q

19、只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针缺缺 点点实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类几种方法的比较几种方法的比较方方 法法优点优点缺缺 点点适适 用用 范范 围围SYBR Green I 方法方法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性带易出现非特异性带适合科研中对各种目的基适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植的研究，转基因重组动植物的研究物的研究TaqMan 方法方法特异性高特异性高重复性好重复性好价格高价格

20、高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基病原体检测，疾病耐药基因研究因研究,药物疗效考核药物疗效考核,遗遗传疾病的诊断传疾病的诊断Molecular beacon 法法(分子信标分子信标)原理原理标记荧光的发夹探针标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补环与目标序列互补茎由互补配对序列组成茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRET）q 探针与探针与DNA杂交时产生荧光杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异

21、性荧光变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 应用范围应用范围 q 起始模板的定量起始模板的定量q 基因型分析基因型分析q 产物鉴定产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析（单核苷酸多态性）分析Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 优缺点优缺点q高特异性：对目标序列高特异性：对目标序列 检测检测SNP最灵敏的试剂最灵敏的试剂 之一之一

22、q荧光背景低荧光背景低优优 点点q 只能用于一个特定目标只能用于一个特定目标q 设计困难设计困难q 价格比较高价格比较高缺缺 点点内容概要内容概要1 荧光定量荧光定量PCR原理原理1 荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1 荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南公司荧光定量产品选择指南荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法（依据课题要求提前确定）（依据课题要求提前确定） 绝对定量解析方法绝对定量解析方法 相对定量解析方法相对定量解析方法 绝对定量解析方法绝对定量解析方法Sample25绝

23、对定量的定义绝对定量的定义0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品始拷贝数的标准品,可作出可作出标准曲线标准曲线,即得到该扩增反应即得到该扩增反应存在的线性关系存在的线性关系0 根据样品根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量值，就可以计算出样品中所含的模板量质粒标准品的制备质粒标准品的制备PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆质粒提取，质粒提取，ODOD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用质粒质粒基因组基因组DNADNA拷贝数的计算：拷贝数的计算：待测样本浓度（待测样本浓度（ng/u

24、l）OD26050稀释倍数稀释倍数样本分子量样本分子量=碱基数碱基数324待测样本拷贝数（待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度待测样本浓度/样本分子量样本分子量61014 倍比梯度稀释方法：倍比梯度稀释方法：1v原液原液(标准品标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算质粒标准品稀释方法与拷贝数计算实时荧光定量实时荧光

25、定量PCRPCR法绝对定量方法法绝对定量方法q 方方 法：法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测q 试试 剂：剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）q 标准品：标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照q 实验步骤：实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量SampleS

26、amplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD标准品510328.1828.6428.410.16标准品510425.2525.1425.190.04标准品510522.1122.4622.280.12标准品510618.6318.9218.770.10未知样品? ?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据实验数据绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量扩增效率（扩增效率（E）计算）计算 E = 10-1/斜率 1 = 10-1/-3.29 1 = 2.0

27、11 = 1.01 标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量相关系数（相关系数（R R2 2）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近1 1，结果可信度越高。，结果可信度越高。 扩增效率（扩增效率（E E）：）：0.9-1.2, 0.9-1.2, 越接近越接近1 1，越理想。，越理想。未知样品拷贝数的计算未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5= -3.29 X + 40.33Quan

28、tityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies 绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量X=20.5-40.33-3.29=6.03 相对定量解析方法相对定量解析方法实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析相对定量的必要性相对定量的必要性必须用内对照基因必须用内对照基因（管家基因）（管家基因）进行校进行校正，进行相对表达量分析。正，进行相对表达量分析。管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因, , 如：如：GAPDHGAPDH、ActinActin、18S rRNA18S

29、rRNA等等筛选方法筛选方法根据文献提供根据文献提供 通过具体实验筛选通过具体实验筛选相对定量分析相对定量分析管家基因筛选管家基因筛选P P P P P P O O 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法TaqManTaqMan法举例法举例TaqMan法研究法研究ERBB2 在乳腺肿瘤在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异组织标本中的表达差异 TaqMan TaqMan法举例标记探针法举例标记探针使用使用 TaqMan TaqMan 探针进行双通道荧光定量探针进行双通道荧光定量q Fam Fam标记目标基因探针标记目标基因探针q VIC VIC标记看家基因探针标记看家基因探针TaqManTaqMa

30、n法举例材料准备法举例材料准备q从正常乳腺组织中提取的总从正常乳腺组织中提取的总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的总从乳腺癌组织中提取的总RNARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线的质粒用于生成标准曲线q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析TaqManTaqMan法举例癌症标记物表达法举例癌症标记物表达Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBBTaqManTaqMan法举例实验结果法举例实验结果定量定量Copies ng/ l

31、 Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 XGAPDH95500857301360001308001.45 XTaqManTaqMan法举例实验结果法举例实验结果定量分析定量分析ERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/ 0.011GraphCopies ng/

32、l Total RNATaqManTaqMan法举例实验结果法举例实验结果表达差异表达差异HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异TaqManTaqMan法举例实验结果法举例实验结果讨论讨论通过通过RT-qPCR成功检测了成功检测了ERBB2基因在基因在不同组织的表达差异；在乳腺癌组织中，不同组织的表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的的表达量是正常水平的1.8倍倍 双标准曲线法双标准曲线法 2 -Ct法法 (CT值比较法值比较法) 相对定量分析相对定量分析两种常用的分析方法两种常用的分析方法 通过标准曲线对对

33、照样品、待测样品的目的基因及管家通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。表达量。 相对值相对值= =校正值校正值= =目的基因定量结果目的基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析相对定量分析双标准曲线法双标准曲线法公式：公式：优点：分析简单，实验优化相对简单优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最

34、常用与公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一相对定量分析相对定量分析双标准曲线法双标准曲线法检测样品检测样品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结定量结果果校正值校正值相对量相对量对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874实验数据实验数据公式：

35、公式：F = 22 2 法法优点：无需作标准曲线优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率接近缺点：假定扩增效率接近 100 %； 假定标准曲线及每次扩增之际间的效假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；率都保持一致；应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 待测组目的基因平均Ct值待测组管家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组管家基因平均Ct值CtCt实验数据：实验数据：Sample 处理前 处理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.40.950.952 - Ct法：法：假

36、设目的基因和参照基因扩增效率都接近假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4） = 5.3 所以所以JunJun基因在处理后表达水平是处理前的基因在处理后表达水平是处理前的5.35.3倍倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于1，那么，那么2Ct可以修正为：（可以修正为：（1E）Ct，例如扩增效率为，例如扩增效率为0.95，那么计算公式可

37、修正为，那么计算公式可修正为1.95Ct2 -2 -CtCt法法内容概要内容概要1 荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1 荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1 荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项1 TIANGEN公司荧光定量相关产品公司荧光定量相关产品荧光定量荧光定量PCRPCR仪的硬件条件仪的硬件条件激发光源激发光源热循环加热、制冷热循环加热、制冷 样品样品检测设备检测设备SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备引物设计引物设计反应条件优化反应条件优化浓度确定浓度确定技能要求技能要求环境要求环境要求误差控制误差控制数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍RT上机上机反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择分析方法分