狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析

1、园 艺 学 报 2014，41（7）：14181426 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140312；修回日期：20140506 基金项目：国家自然科学基金项目（31171993） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：Zhaolj5073） 狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析 王 玲，高 彬，温 超，郗 琳，刘凤栾，马 男，赵梁军* （中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193） 摘 要：利用RACE

2、技术从狗蔷薇（Rosa canina）类根体中克隆得到1个细胞分裂素氧化酶基因cDNA全长，命名为RcCKX5。序列分析表明，RcCKX5 cDNA全长1 815 bp，5 UTR 104 bp，ORF 1 626 bp，3 UTR 85 bp，编码541个氨基酸，具有CKX家族典型的FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域和CK（细胞分裂素）结合域。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示RcCKX5与可可TcCKX5亲缘关系最近，与拟南芥AtCKX5、乌拉尔图小麦TuCKX5同源性较高。荧光定量PCR分析表明，狗蔷薇RcCKX5在其根、茎、叶、花、果实中均有表达，根中相对表达量最高，花和果实中相对

3、表达量较高。在狗蔷薇类根体形成发育过程中RcCKX5的相对表达量不断升高，21 d时达到最高，随后稍有下降，表明其可能参与了类根体的形成。6-BA处理结果表明RcCKX5能够快速响应6-BA的诱导，表达量显著上调，2.5 mg · L-1 6-BA处理120 h时，RcCKX5的相对表达量达到最高峰。 关键词：狗蔷薇；类根体；细胞分裂素氧化酶；表达分析 中图分类号：S 685.12 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1418-09 Isolation and Expression Analysis of Cytokinin Dehydrogenase Ge

4、ne RcCKX5 in Rosa canina WANG Ling，GAO Bin，WEN Chao，XI Lin，LIU Feng-luan，MA Nan，and ZHAO Liang-jun* （Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China） Abstract：Protocorm-like bodies（PLBs）is a new protocol of efficient regeneration，an

5、d the development of rhizoids is a critical stage of PLB regeneration. Recent researches showed that cytokinin regulated the formation of rhizoids. Here，we isolated the full length cDNA of a gene encoding cytokinin dehydrogenase from rhizoids of Rosa canina，named RcCKX5. Sequence analysis indicated

6、that RcCKX5 consisted of 1 815 bp，with ORF of 1 626 bp，5 UTR of 104 bp，3 UTR of 85 bp，encoded 541 amino acids. The deduced amino acids possessed conserved domains of CKX family，FAD-binding domain and cytokinin-bining domain. Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis showed that RcCKX5 h

7、ad the highest similarity with TcCKX5 from Theobroma cacao. Real-time PCR analysis indicated that expression level of RcCKX5 in root was the highest，and expression level in flower and fruit was high. 7期 王 玲等：狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析 1419 Expression level of RcCKX5 keep increasing all along the fo

8、rmation of rhizoids，reached the highest peak in the twenty-first day，then decreased slightly. This indicated RcCKX5 might be involved in rhizoids formation. RcCKX5 was significantly and rapidly induced by 6-BA，expression level of RcCKX5 reached highest with the concentration of 2.5 mg · L-1 and

9、 time of 120 h. Key words：Rosa canina；rhizoid；cytokinin dehydrogenase；expression analysis 类原球茎（protocorm-like body，PLB）再生途径是一种高效的、具有一定普遍性的再生体系，可作为良好的遗传转化体系用于月季等蔷薇属植物的育种开发和研究工作（Tian et al.，2008；Guo & Zhao，2011）。植物的再生，如器官发生和体胚发生，都受激素水平的影响，多种激素之间平衡互作共同调节植物的离体再生。已有研究表明生长素和细胞分裂素对PLB再生起着重要的作用（张建甫 等，20

10、11；Gao et al.，2013）。狗蔷薇（Rosa canina）的PLB是由叶片经愈伤组织形成类根体，类根体根尖再膨大萌发而形成的。因此，类根体阶段是PLB再生体系的关键阶段，是影响再生效率的重要因素，对类根体的研究有助于对PLB的深入研究和利用。有研究发现，在类根体诱导过程中添加激动素（Kinetin，KT）会降低类根体的发生率，细胞分裂素能够负调控类根体的形成（Gao et al.，2013）。但关于细胞分裂素如何调控类根体形成，还有待进一步研究。 细胞分裂素氧化酶（Cytokinin dehydrogenase，CKX）是目前已知的唯一能够催化天然细胞分裂素发生不可逆降解的酶,是

11、降解内源细胞分裂素（Cytokinin，CK）的关键酶。该酶以分子氧为氧化剂，催化CK的N6上不饱和侧链裂解使其彻底丧失活性（Hare & van Staden，1994）。CKX是下调内源细胞分裂素水平的关键酶，很多研究发现过表达CKX的转基因植株内源细胞分裂素水平与对照相比明显下降（Galuszka et al.，2001；Kopený et al.，2006；Werner et al.，2006）。 目前，关于细胞分裂素氧化酶的研究多集中于拟南芥和禾本科植物中，如玉米、水稻等。拟南芥中已得到7个CKX基因（Werner et al.，2003）、玉米中已发现13个CKX

12、基因（Gu et al.，2010）。不同的CKX蛋白之间都具有高度保守的FAD结合域和CK结合域，在功能方面具有一定的相似性。CKX基因广泛存在于植物体内各个部位，但不同成员的表达特性存在一定差异。拟南芥CKX基因均在根和芽中大量表达。CKX参与调节植物多种生长发育过程。CKX能够调节拟南芥根和芽的生长发育（Ferreira & Kieber，2005；Riefler et al.，2006）。细胞分裂素可正调控茎分生组织而对根有抑制作用（Hewelt et al.，1994；Kuderova et al.，2008），CK缺乏会抑制茎分生组织且促进根的生长发育。过表达拟南芥CKX基

13、因的烟草和拟南芥表现出植株矮化、茎的生长受抑制，主根增长、侧根增多、根系扩大等表型（Laplaze et al.，2007）。另外，CKX能调控生殖器官发育（Igarashi et al.，2009）、种子形成和作物产量（Ashikari et al.，2005；Bartrina et al.，2011）等。CKX还与植物衰老（Mytinova et al.，2010）及逆境反应（Mytinova et al.，2010；Macková et al.，2013）有关。 本试验中利用RACE技术分离得到狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的cDNA全长，分析其在不同组织和类根体发育过

14、程中的表达特性，以及响应6-BA处理的表达情况，揭示该基因的功能和特性，探索细胞分裂素如何参与调控类根体形成，为研究激素对PLB发生发育的影响及进一步优化这一再生体系提供理论参考。 1 材料与方法 1.1 材料 试材为狗蔷薇（Rosa canina），来源于中国农业大学科学园。取一年生茎段消毒灭菌，以其单芽1420 园 艺 学 报 41卷 表1 引物名称及对应序列 Table 1 Primer names and corresponding sequences 引物名称 Primer name 相应序列 Corresponding sequence RcCKX5-F1 CGGCCTGGGCCA

15、GTTYGGNATHAT RcCKX5-R1 AGCCAGGGGTGGGGNAVNTCCCA RcCKX5-F2 AACAACTGGAGGTCATCTTTCT RcCKX5-R2 GGATCAATGGAGGAGATATTGACAGGGT full-RcCKX5-FCTGCCTCAAGATTTTGCTTCATTCC full-RcCKX5-RTACATCCCTCCCTAAGTTTGTTGCT q-RcCKX5-F ACGAGGGAGTGTTCAAGGGCA q-RcCKX5-R GTTTCGTCCCCGGAATCCAAAG 18Sr-F CGCTACACTGATGTATTCAACGAGC 18S

16、r-R ACAATAATCCTTCCGCAGGTTCACC 茎段为外殖体接种于MS培养基上（含6-BA 1.0 mg · L-1，NAA 0.004 mg · L-1，GA3 0.1 mg · L-1），通过腋芽诱导获得组培苗并继代扩繁，置于人工培养室中培养。温度25 ，16 h光照/8 h黑暗，光照强度100 120 mol · m-2 · s-1。类根体诱导参照Tian等（2008）的方法。 将狗蔷薇组培苗叶片接种于添加2.5 mg · L-1 6-BA的类根体诱导培养基（即MS + 1.5 mg · L-1 2,4-D

17、）上，置于人工培养室分别暗培养处理0、4、8、16、24、72和120 h；另外将组培苗叶片分别接种于添加6-BA 0、0.025、0.1、0.25、1.0、2.5和5.0 mg · L-1的类根体诱导培养基（即MS + 1.5 mg · L-1 2,4-D）上，置于人工培养室暗培养处理24 h。收集材料，液氮冷冻，置于80 保存待用。 1.2 狗蔷薇RcCKX5的克隆 采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒（华越洋生物科技有限公司，下同）从狗蔷薇类根体中提取总RNA，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。反转录使用Superscript reverse transcr

18、iptase（Invitrogen）进行，合成cDNA第1链。 根据GenBank上发表的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu）、可可（Theobroma cacao）的CKX5保守氨基酸序列和核苷酸序列，通过Primer Premier 5软件设计简并引物RcCKX5-F1和RcCKX5-R1（表1），以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 5 min；94 30 s，60 30 s，72 1 min，35个循环；72 10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段并连

19、接到载体pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），转化大肠杆菌DH5（北京全式金生物技术有限公司），进行Ampicillin抗性筛选及阳性克隆鉴定，进行DNA测序，（北京中科希林生物科技有限公司，下同），得到RcCKX5中间片段。 采用RACE试剂盒（大连宝生物工程有限公司）扩增RcCKX5的3 与5 序列。根据所得到的中间片段序列设计3 特异性引物RcCKX5-F2（表1），扩增得到3 端序列；再设计5 特异性引物RcCKX5-R2（表1），扩增得到5 端序列。DNAMAN 6.0软件拼接所获得序列，分别在5 端和3 端非翻译区设计特异性引物full-RcCKX5-F和full-RcCKX5

20、-R（表1），进行校正，反应条件为：94 5 min；94 30 s，60 30 s，72 2 min，35个循环；72 10 min。扩增得到含开放阅读框的cDNA全长，测序。 1.3 序列生物信息学分析 利用NCBI的ORF Finder，对RcCKX5的cDNA序列开放阅读框进行查找；利用NCBI网站的BLAST程序搜索相似性序列；利用蛋白质理化性质预测软件（http：//protparam/）预测该蛋白质的分子量和等电点；使用ClustalX 1.81软件进行多重序列比对；采用MEGA 4.0构建系统进化树，用自展法（Bootstrap）进行1 000次重复

21、测试，数字表示不同节间的进化距离。 1.4 基因表达特性分析 根据所得cDNA序列设计一对基因特异性引物q-RcCKX5-F和q-RcCKX5-R（表1），以18SrRNA 作为内参基因，其特异性引物为18Sr-F和18Sr-R（表1）。将相应材料提取RNA并消化，采用FastQuant 7期 王 玲等：狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析 1421 RT Kit（With gDNase）（天根生化科技有限公司）反转录合成cDNA第一链，进行荧光定量PCR分析。荧光定量PCR采用KAPA SYBR FAST Universal 2× qPCR Master Mix（

22、KAPA），按其说明书配制反应体系，每个处理重复3次，在ABI StepOne Plus仪器上进行扩增分析。 2 结果与分析 2.1 狗蔷薇RcCKX5基因全长的获得 利用RACE的方法，从狗蔷薇中分离得到RcCKX5cDNA全长（图1）。该基因cDNA全长1 815 bp，5 UTR 104 bp，ORF 1 626 bp，3 UTR 85 bp，编码541个氨基酸，GenBank登录号为KF964496。蛋白质结构域分析表明，RcCKX5编码的氨基酸序列具有CKX家族的两个特征结构域：FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域和CK结合域。蛋白质理化性质预测其分子量为60.0 kD，等电点为5.4

23、1。 图1 RcCKX5基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide sequence of RcCKX5 cDNA and deduced amino acid sequence 2.2 RcCKX5编码的氨基酸序列的生物信息学分析 将RcCKX5编码的氨基酸序列与GenBank上其他植物的CKX5同源蛋白序列拟南芥AtCKX5（NP_177678.2）、玉米ZmCKX5（NP_001185958.1）、乌拉尔图小麦TuCKX5（EMS58043.1）、可可TcCKX5（EOY14870.1）进行多重序列比对，结果（图2）显示RcCKX5与其他CKX5氨基酸序列具

24、有较高的同源性，有多个保守区域。RcCKX5与可可TcCKX5的同源性高达80.2%，与拟南芥AtCKX5、乌拉尔图小麦TuCKX5和玉米ZmCKX5的同源性也分别达到了73.4%、63.8%和49.7%。 1422 园 艺 学 报 41卷 图2 RcCKX5氨基酸序列同其他物种CKX5氨基酸序列比对 Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequence of RcCKX5 with CKX5 from other species 为了分析RcCKX5与其他CKX同源蛋白的系统进化关系，将其与其他13种植物CKX同源蛋白进行多重序列比对，并用M

25、EGA 4.0构建了系统发育树。结果（图3）显示RcCKX5与可可TcCKX5的亲缘关系最近，其次与拟南芥AtCKX5、乌拉尔图小麦TuCKX5亲缘关系较近，而与单子叶的玉米ZmCKX5和石斛兰DsCKX1的进化关系相对较远。 图3 RcCKX5推测蛋白同其他物种CKX同源蛋白的系统进化树分析 图中数字代表进化距离。 Fig. 3 The phylogenetic tree of RcCKX5 and CKX proteins from other species Number in the figure represent evolutionary distance. 7期 王 玲等：狗蔷薇

26、细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析 1423 图5 类根体诱导过程中不同时期RcCKX5基因的表达 Fig. 5 Expression analysis of RcCKX5 during the formation of rhizoids 图4 RcCKX5基因在狗蔷薇不同组织中的表达 Fig. 4 Exression pattern of RcCKX5 in different tissues of Rosa canina 2.3 狗蔷薇RcCKX5组织表达特性分析 如图4所示，狗蔷薇RcCKX5在根、茎、叶、花、果实中均有表达，在根中的表达量最高，在花、果实中表达量次之，在叶

27、和茎中表达量最低，其中在根中的表达量是在茎中的8.7倍。 2.4 狗蔷薇RcCKX5在类根体诱导过程中的表达情况 从图5和图6中可以看出，接种叶片后类根体的诱导过程开始之后，RcCKX5的表达量逐渐增高，21 d时表达量最高，为0 d的20.2倍，随后有所下降，28 d时表达量为0 d的16.7倍。 分析类根体诱导过程中RcCKX5的表达情况可以发现，14 21 d之间叶片形成的愈伤组织开始分化形成类根体，RcCKX5的表达量迅速增高达到最高峰，类根体成熟后表达量下降，这说明RcCKX5的表达与类根体的发生呈现正相关关系，RcCKX5可能参与了类根体的发生。 图6 类根体诱导过程中不同时期的生

28、长状态 Fig. 6 Growth state in different time during the formation of rhizoid 2.5 细胞分裂素6-BA处理对狗蔷薇RcCKX5表达的影响 通过不同浓度细胞分裂素6-BA处理类根体诱导过程中的叶片，结果如图7所示，随着6-BA处理浓度的升高，RcCKX5的表达呈逐步上升的趋势。其中浓度为2.5 mg · L-1时表达量达到最高，在处理浓度为0.25 2.5 mg · L-1时，表达量均明显高于对照，说明6-BA能够诱导狗蔷薇RcCKX5的表达。 如图8所示，细胞分裂素6-BA处理类根体诱导过程中的叶片不同

29、时间，RcCKX5的相对表达量存在较大差异。处理后4 h RcCKX5表达量迅速增高，达到对照的9.1倍，随后逐渐降低，24 h表达1424 园 艺 学 报 41卷 量最低，之后又不断升高，72 h和120 h时的表达量分别达到对照的10.6倍和15.3倍。这些结果表明细胞分裂素6-BA能够快速而显著地上调RcCKX5的表达。 3 讨论 狗蔷薇PLB再生体系具有一定普适性和高效性，可以作为一种良好的遗传转化体系用于月季的研究和育种开发工作。类根体是狗蔷薇PLB再生的关键阶段，对类根体形成机制的研究有利于PLB再生体系的深入研究和利用。已有研究证明，生长素和细胞分裂素对于类根体的形成起着重要的作

30、用，但细胞分裂素调控类根体形成的机制还不太清楚。 本试验中从狗蔷薇中克隆得到1个细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5 cDNA的全长。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示与TcCKX5亲缘关系最近，与AtCKX5、TuCKX5等均具有较高的同源性，且具有保守的FAD结合域和CK结合域。这些结果表明，RcCKX5为CKX家族同源基因，可能与其他CKX具有相似的结构和功能。 组织表达分析表明，狗蔷薇RcCKX5在根、茎、叶、花、果实中均有表达，相对表达量依次为根 > 花 > 果实 > 叶 > 茎。这与其他植物CKX的研究结果相似。拟南芥AtCKX5在根分生组织、雄蕊和花药、腋

31、生分生组织以及叶中的表达量都较高（Werner et al.，2006）。CKX广泛存在植物体内各个部位，玉米CKX主要在谷粒、根、老叶、成熟和未成熟的雄穗、未成熟的雌穗中大量表达（Bilyeu et al.，2003；Massonneau et al.，2004）。大多数CKX基因都在根中大量表达（Werner et al.，2006；Liu et al.，2013）。RcCKX5在根中的大量表达说明其对根器官的生长发育起着重要的作用。相关研究表明CKX能够促进根的发育，过表达CKX的转基因植株均表现出主根变长，侧根不定根增长，根分生组织增大的表型（Schmülling et al

32、.，2003；Lohar et al.，2004；Laplaze et al.，2007）。 类根体诱导发生过程中，RcCKX5的表达量逐渐升高，在21 d时达到最高，是0 d的20.2倍，此时是类根体发生的旺盛时期，28 d时即类根体成熟后表达量稍有下降。RcCKX5表达量的变化与类根体发生过程相一致。CKX能够负调控内源CK的水平（Kowalskaa et al.，2010；Dung et al.，2012），因此分析认为RcCKX5的表达量的变化可能造成内源CK水平的变化，改变了激素平衡从而调节类根体的形成。另外，有研究证明细胞分裂素在根中能够抑制根原基，并能调节根部细胞脱离根分生组织促

33、进维管组织的分化，过表达CKX能够逆转这种作用（Werner et al.，2006；Dello et al.，2007）。图7 不同浓度6-BA处理（24 h）对RcCKX5表达的影响 Fig. 7 Effect of 6-BA treated with different concentration （24 h）on expression of RcCKX5 图8 6-BA（2.5 mg · L-1）处理时间对RcCKX5表达的影响 Fig. 8 Effect of 6-BA（2.5 mg · L-1）treated for different time on expr

34、ession of RcCKX5 7期 王 玲等：狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析 1425 RcCKX5在类根体发育过程中的表达特性以及在狗蔷薇根中的大量表达均说明该基因的表达与类根体的发生呈现出正相关关系，具体是否参与了类根体发生还不能明确判断。 目前，关于CKX表达的可诱导性的报道有很多，大量的研究显示细胞分裂素能够迅速地上调CKX的表达。Brugière等（2003）研究发现6-BA处理玉米叶片24 h，ZmCKX1的表达显著上调，响应过程很迅速。小麦已发芽的胚经10 mol · L-1的6-BA处理12 h，TaCKX3即受到强烈诱导（Ma

35、et al.，2011）。本研究中对类根体诱导过程中的狗蔷薇叶片施加不同浓度的6-BA处理，RcCKX5的表达量随6-BA浓度的升高不断上升，2.5 mg · L-1时表达量最高，随后稍有下降，在一定浓度范围（0.25 2.5 mg · L-1）内表达量明显上调，表明细胞分裂素能够诱导RcCKX5的表达。进一步分析RcCKX5响应6-BA表达调控的特性，发现叶片经6-BA处理4 h时后，RcCKX5表达量迅速升高，120 h时表达量最高，达到对照的15.3倍，这说RcCKX5能够迅速的响应细胞分裂素的表达调控。这与其他相关研究结果相一致。4 24 h表达量短时间内的下降可能

36、与培养过程中存在2,4-D有关，2,4-D可能动态地参与调节了RcCKX5表达。王瑛（2009）用2,4-D处理霍山石斛试管苗15 d，DhCKX的酶活性仅达到对照的58.1%。 综上所述，RcCKX5可能一定程度参与了类根体的形成过程，今后可通过测定类根体形成不同时期的细胞分裂素含量进一步明确细胞分裂素与类根体形成的关系，为研究激素调控PLB再生的机理提供一定的依据。 References Ashikari M，Sakakibara H，Lin S，Yamamoto T，Takashi T，Nishimura A，Angeles E R，Qian Q，Kitano H，Matsuoka M.

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