芳酸及其酯类药物的分析

1、芳酸及其酯类药物的分析,基 本 要 求,一、掌握水扬酸类、苯甲酸类药物的鉴别和含量测定的基本原理与方法。 二、熟悉其他方酸类药物鉴别和含量测定的基本原理与方法。 三、了解本类药物的体内分析方法,返 回,一、水扬酸类 （一）典型药物结构,第一节 典型药物分类与理化性质,水杨酸（salycylic acid,阿司匹林（aspirin,对氨基水杨酸钠 （sodium aminosalicylate,双水杨酯（salsalate,贝诺酯（benorilate,1.酸性 SA(PKa2.95)、ASA(PKa3.49)、双水杨酯均有酸性。 2. 溶解性: 均为固体，有一定溶点。除钠盐溶于水，其余不溶。

2、3. UV和IR光谱特性：分子结构中具有苯环,有UV和IR特征吸收。 4. 芳伯氨基和酚羟基特性： 5. 水解特性：ASA、双水杨酯及其制剂应检查水杨酸,对氨基水 杨酸钠和贝诺酯检查间氨基酚和对氨基酚,二）主要理化性质,一）典型药物结构,苯甲酸及其钠盐 (benzoic acid,二、苯甲酸类,羟苯乙酯(ethylparoben,丙磺舒(probenecid,甲芬那酸(mefenamic acid,二）主要理化性质,1. 溶解性: 均为固体，有一定溶点。除钠盐溶于水，其余不溶。 2. UV和IR光谱特性：分子结构中具有苯环,有UV和IR特征吸收。 3. 具有酚羟基特性： 4.分解反应特性：苯甲

3、酸钠分解为苯甲酸；丙磺舒分解为SO2 5. 酸性：苯甲酸、丙磺舒和甲芬那酸有游离的羧基 ，可用 NaOH直接滴定测定其含量,三、其他芳酸类 (一)典型药物结构,氯贝丁酯（clofibrate,布洛芬（ibuprofen,二)主要理化性质 1.溶解性：水中不溶，有机溶剂溶解，氯贝丁酯为液 体；布洛芬为固体，有一定熔点。 2.UV和IR特征吸收光谱：基于分子结构中具有苯环和 特征基团,返 回,一、与三氯化铁反应 含有酚羟基药物可与FeCl3反应；能与FeCl3反应不 一定含酚羟基,第二节 鉴别试验,1. 直接反应 SA在中性或弱酸性条件下，与FeCl3生成紫堇色配 位化合物,丙磺舒与NaOH成钠盐

4、后，在pH 5.06.0中与FeCl3生成米黄色 布洛芬与高氯酸羟胺，N，N-双环基己羧二亚胺及高氯酸铁反应， 即显紫色JP（14）方法。基于分子中-COOH的结构,2. 水解或分解后与三氯化铁反应,ASA水解成SA后与FeCl3 反应，成紫堇色,二、重氮化-偶合反应 凡是分子结构中含有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物均可反应,1. 直接反应 对氨基水杨酸钠 2. 水解后反应 贝诺酯具有潜在芳伯氨基 3. 甲芬那酸与对-硝基苯重氮盐在NaOH介质中偶合产 生橙红色,K2Cr2O7 深蓝色 棕绿色 甲芬那酸 + H2SO4 黄色 绿色荧光JP(14,三、氧化反应,1. ASA酸水解生成SA和CH3C

5、OOH：SA的mp为156 161 。 2. 双水杨酯水解生成SA：SA的mp为158。 3. 氯贝丁酯碱水解后与盐酸羟胺生成异羟肟酸盐， 在弱酸条件下再与三氯化铁反应生成紫色的异 羟肟酸铁,四、水解反应,1. 苯甲酸盐加热分解生成苯甲酸升华物，可用于鉴别。 2. 丙磺舒与NaOH熔融分解成Na2SO3, 经硝酸氧化成 Na2SO4。 3. 丙磺舒加热分解，生成SO2气体，有臭味,五、分解产物反应,1. 测定max ；min。 例如：布洛芬用0.4%NaOH溶液制备0.25mg/ml； max ； 265nm, 273nm; min。245nm, 271nm。 2. 在max 处测定一定浓度供

6、试液的吸收度A。 例如：羟苯乙酯，5g/ml max =295nm; A = 0.48 3. 在max 处测定供试液的百分吸收系数。 例如：贝诺酯在max =240nm; E1%1cm = 730760,六、紫外吸收光谱法,4. 在规定的波长测定吸收度比值（即双波长吸收度 比值法） 例如：对氨基水杨酸钠10g/ml; A265/A299 = 1.561.56 再例如：甲芬那酸14g/ml; A278280/A348352 = 1.151.30,七、红外吸收光谱法,水杨酸的红外吸收图谱,37002900cm-1,N-H、 O-H,1660cm-1,C=O,1610,1570 1480,1440,

7、C=C,775cm-1,Ar-H,返 回,37002900cm-1,N-H、 O-H,1640cm-1,N-H,1580cm-1 1500cm-1,C=C,1300cm-1,C-N,1188cm-1,C-O,对氨基水杨酸钠的红外吸收图谱,第三节 特殊杂质检查,一、ASA中特殊杂质的检查 1.溶液的澄清度 主要检查Na2CO3中不溶物，有苯酚；醋酸苯酯；水杨酸苯酯；乙酰水杨酸苯酯。ASA溶解因此ASA溶液应澄清。 2. 游离水杨酸检查 利用SA 可与FeCl3呈色，用比色法检查。 3. 易炭化物检查 主要检查ASA中能被硫酸炭化显色的低分子有机杂质。采用与标准比色液比色的方法检查,主要检查成品药

8、物中可能残留的间氨基酚。间氨基 酚易氧化呈色，而且有毒性，因此要严格控制。 双向滴定法：利用间氨基酚溶于乙醚，取3.0g 样品用乙醚提取0.02mol/LHCl 测定方法 滴定V0.3ml。 HPLC法：采用内标法，以磺胺作内标（USP,二、对氨基水杨酸钠中特殊杂质的检查,三、羟苯乙酯中有关物质的检查,BP收载的方法，由于杂质的结构不清，故采用TLC法中的 供试品自身对照法,固定相：GF254C18化学键合硅胶,展开剂：甲醇-水-冰醋酸,反相TLC法,甲芬那酸是以邻-氯苯甲酸和2，3-二甲基苯胺在Cu的催化下 缩合而成，因此成品药物中要检查铜盐及有关物质。 分光光度法：利用Cu 2+与Na-D

9、DC呈色后测定A 1. 铜盐检查法 原子吸收分光光度法：BP（2000） 2. 有关物质的检查 主要检查的是酰胺、二甲基苯胺和邻氯苯甲 酸各国药典均采用TLC法中的自身高低浓度对照法,四、甲芬那酸中特殊杂质的检查,五、氯贝丁酯中特殊杂质的检查,主要检查成品药物中残留的对氯酚原料和挥发性杂质,GC-FID法,HPLC法：以对-羟乙基酚作内标，用正相HPLC,2. 挥发性杂质的检查方法 GC法,1. 对氯酚检查,返 回,一、酸碱滴定法 （一）直接滴定法 基于本类药物-COOH；可用碱直接滴定，如 ASA的含量测定，其原理如下,第四节 含量测定,1. 原理,2. 条件,在中性乙醇中，以酚酞作指示剂；

10、摩尔比为1:1,3. 应用,多国药典用于双水杨酯、苯甲酸、丙磺舒、布洛芬测定；USP和BP还用于甲芬那酸的测定,二）水解后剩余滴定法 1. ASA含量测定,原理,条件,水溶液,具体试验,I 份NaOH,I 份NaOH,V,VO,Vo-V相当于ASA消耗 硫酸的ml数,ASA% = (Vo V)FT/W 100,2. 羟苯乙酯的含量测定,三）两步滴定法,1. ASA片的含量测定,第一步为中和,ASA + NaOH,ASA-Na + H2O,水解产物SA + NaOH,SA-Na + H2O,酸性稳定剂+ NaOH,中性盐,第二步为水 解与测定,2. 氯贝丁酯含量测定 第一步：中和酸性杂质 第二步

11、：水解与测定,二、亚硝酸钠滴定法,对氨基水杨酸钠有芳伯氨基,在HCl中与 NaNO2发生重氮化反应,Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl,Ar-N2Cl + NaCl + 2H2O,因此可用亚硝酸钠滴定法测定其含量，此法在下章重点讨论,三、双相滴定法,是指在水相和有机相中的滴定。如苯甲酸钠的含量测定,生成的苯甲酸不溶于水，终点pH突跃不明显，不易观察。 苯甲酸在乙醚中易溶，在水相中加入乙醚将滴定中产生的苯甲酸萃取入醚层。因此用双相滴定可使反应完全终点明显,一）直接紫外分光光度法 丙磺舒片的测定：Ch.P(2000) 在HCl中，采用百分吸收系数法。 BP(1998)再盐酸-乙醇,采用百分

12、吸收系数法. USP(24)用氯仿提取后，采用对照品比较法,四、紫外分光光度法,二）离子交换-紫外分光光度法,氯贝丁酯及其制剂 Ch.P(2000)采用酸碱滴定法；当含有酸性杂质对氯酚时，可采用强碱性阴离子交换树脂吸附酸性杂质后， 在甲醇溶液中，226nm波长处，采用对照品比较法。 具体计算：W1000 1/100 1/100 = Cu (g/ml) Au/As = Cu/C Cu = C(Au/As) W(mg) = 10 Cu = 10 C(Au/As,三）柱分配色谱-紫外分光光度法,USP(24)采用此法同时测定ASA胶囊中 ASA和SA。 1. SA的限量测定 色谱柱的制备；对照品溶液

13、的制备；供试 品溶液的制备,供试品液：CHCl3液,洗脱液1：CHCl3 洗脱液2：HAC- 乙醚,硅藻土，FeCl3-尿素,玻璃棉,硅藻土，Na2CO3,供试品液：CHCl3-HCl液,洗脱液1：HAC-CHCl3 (1:10) 10ml 洗脱液2：HAC- CHCl3 (1:100) 85ml,1-杂质先洗脱 2-SA后洗脱,max=306nm AuAs,1-杂质先洗脱 2-ASA后洗脱,max=280nm ASA(mg)=C(Au/As,2. ASA的含量测定 色谱柱的制备；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备,Ch.P(2000)ASA的胶囊剂的含量测定采用此法。 USP（24）ASA片

14、、对氨基水杨酸钠、甲芬那酸、布洛芬、丙磺舒等及其制剂，采用此法,五、HPLC法,一）ASA栓剂的含量测定,色谱条件：色谱柱ODSC18；流动相为甲醇：0.1%二乙胺：HAC (40:60:4);检测波长280nm；内标物为咖啡因。 系统适用性试验： n 2000; ASA与SA与内标物的R 1.5 具体计算： Cx = Rx/RRCR W(g) 1/50 2/50 = Cx W测 = 1250 Cx,标示量% = W测/W W平/标示量100% = Cx 1250 W平/W 标示量100,色谱条件：色谱柱苯基硅胶柱；流动相为NaH2PO3 0.1% HAC液- 0.1% HAC乙腈液(50:5

15、0);检测波长254nm。 系统适用性试验： n 3900; T 2.3; 重复性 RSD1.5% 具体计算,二）丙磺舒原料的含量测定,W 1/100 = Cu(mg/ml); Cu = Au/As C 供试品中丙磺舒(Mg)=100C(Au/As,返 回,一、血清中ASA和SA浓度的HPLC法 色谱条件：色谱柱为ODS-C18(150mm 4.6mm, 5m) 流动相为甲醇-水-正丁醇(30 :20 :1) 检测波长为237nm；内标物为苯甲酸。 血清样品预处理 血清100 l + HClO450 l + 不同浓度ASA和SA + 内标液 涡旋混合2min 离心5min 取上清液20 l进样

16、,第五节 体内药物分析,回归方程：以峰高比（H标/H内）对浓度回归 ASA的回归方程：Y = 5.810-3 + 5.2910-2X r = 0.9996 SA的回归方程：Y = 6.010-3 + 8.3310-2X r = 0.9981 ASA和SA的线性范围分别为：120 g/ml; 230 g/ml 回收率：空白血清 + 五种不同浓度测定，ASA为96.0%106.0%; SA为92.0%119.5%;（五种不同浓度均应在线性范围内,色谱条件：色谱柱为LiChrospher100RP(125mm4mm, 5m) 流动相为25%乙腈溶液-醋酸缓冲溶液梯度洗脱。 检测波长为254nm；内标

17、物为依他尼酸。 尿样品预处理：C8固相萃取柱，100mg填料/ml用甲醇1.0ml,然后 用0.5ml蒸馏水活化。 2.0ml尿样 + 内标300l(10g/ml) 上柱 1.0ml水洗 脱生物杂质 再用甲醇0.5ml洗脱保留在柱上的丙磺舒和内 标。洗脱液0.45m浸滤膜滤过，取5l直接进样分析,二、尿中丙磺舒的固相萃取净化-HPLC法(运动员违禁药物,线性关系和回收率： 取空白尿样2.0ml +不同浓度丙磺舒+内标液 按上述方法 分析(浓度范围为0.1g/ml 100g/ml) ;A丙/A内对C丙回归。 回收率：丙磺舒为100%3%(n=14)；内标为101%3%(n=12)； 人尿样测定：

18、丙磺舒(单剂量500mg)尿排泄药-时曲线(见P136,三、HPLC法测定人血浆中布洛芬含量 色谱条件：色谱柱为Shim-packCLC-ODS(150mm6mm, 10m) 预柱为YWG-C18；流动相为甲醇-20mol/L磷酸二氢 钾冲溶液(70:30, pH=4.0); 流速为1.0ml/min; 检测波长为221nm；内标物为肉桂酸。 样品预处理：取肝素抗凝血浆0。24ml+内标液+甲醇0.5ml,振荡 混匀，离心(1000r/min)15min,取上清液10 l直 接进样分析。布洛芬和肉桂酸tR为5.15和2.85min,回归方程：以对照品与内标的峰高比对浓度回归，其回归方程为： Y = 4.05 10-2C 2.0 10-3, r = 0.9999。 回收率测定：空白血浆 + 布洛芬对照品高、中、低三种浓度， 按样品处理项下测定，测得平均回收率为99.2 1.6%。 精密度：日内精密度为RSD1.8%；日间精密度为2.8,1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0h自肘静脉 取血1.5ml，肝素抗凝，按“样品处理方法”项下操作，求算