色谱技术精解.ppt

1、色谱现象,In 1903，俄国植物学家Michael Tsweetts Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384). Chromatography = (chromatus = color, graphein = to write).,A、图形包含的意义 B、分离机制 C、柱效 D、分离度,纸层析,色谱分离图示,层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。 马丁（A. J. P. Martin）（英）,7 液相色谱,1、一般过程 2、分类 3、名词术语 4、理论 4.1、塔板

2、理论 4.2、速率理论 4.3、分离度 4.4、定性分析 4.5、定量分析 4.6、定量方法 5应用: 违禁药物分析,层析的发展史,7.1 色谱原理与分类,组件及过程： A色谱柱(column)： B固定相(stationary phase)： C流动相(flow phase)： D洗脱液(elution)： E检测器(detector)： F部分收集器(portion collector),7.1.2色谱分类,1)、按应用的目的 A、制备性色谱 (preparation Chromatography)：工业规模，实验室规模 B、分析性色谱 (analytical Chromatography

3、)：GC、LC、HPLC、TLC等。,2)、按流动相 A、GC: 气-固色谱法(固定相为固体) 气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相) B 、LC 液-固色谱(固定相为固体) 液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上),3)、按色谱的展开形式 A、柱色谱法 B、毛细管色谱法 C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱,按处理量分,分析色谱 （10mg） 半制备色谱 (10-50mg) 制备色谱 (0.1-1g) 工业生产规模色谱 (20g/d) 年产10g合格的重组人粒细胞集落刺激因子（rhGM-CSF），其产值高达1亿元。 Recombinant Human Granuloc

4、yte-Macrophage Colony Stimulating Factor,CSF药理作用： 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激 粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。,【适应症】 1.预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症。 2.治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征。 3.预防白细胞减少可能潜在的感染并发症。 4.使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。,纸层析,是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析 介质：滤纸

5、操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂 ，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹。,展开剂的选择,展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂。 常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2） 展开方式：3种 上行色谱 下行色谱 径向色谱,纸层析和薄层层析分离过程,纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。,纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。 将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样

6、点时，带动试样向上运动。,薄层色谱法,将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法 常用的固定相有： 硅胶和氧化铝 优点： 设备简单、操作方便 快速 显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色 灵敏度高（较纸层析） 可以大量制备,操作技术,1.层析纸和层析板 特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。,2.展开剂,由一种或多种溶剂按一定比例组成。 如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为： 正丁醇：乙酸：水=4：1：1。,3. 点样,用微量注射

7、器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm 。可并排点多个试样同时展开。,4.显色、检测,有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。,特点及应用,平板色谱简单、方便、及操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。 试样一般不需要经过预处理即可分离。,应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被

8、使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。,Column Chromatography,柱层析系统,1、工艺流程图,层析柱 径高比（1：101：100）、 材质（玻璃、有机玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.0510 MPa）等 3. 泵恒速、压力（蠕动泵、柱塞泵等） 4. 馏分收集仪手动、自动,5. 检测仪 通用型示差折光、介电常数、电导等 专用型紫外、荧光、放射性检测器等 6. 记录仪 工作站色谱参数的选择和设定、自动化操作、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、数据后处理、自动打印出一套完整的色谱分析数据,实验室用的层析柱,工业用的层析柱,蠕动泵,自动馏分收集仪

9、（国产）,自动馏分收集仪（进口）,国产柱层析系统,伯乐公司（BIO-RAD）柱层析系统,法玛西亚公司（Pharmacia）柱层析系统,柱色谱洗脱方法,洗脱一般有三种方法： 恒定洗脱法： 逐次洗脱法： 梯度洗脱法： 梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。,浓度梯度制造器,柱色谱系统的组成,色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成(图2)。,柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成： A 蠕动泵 B 层析柱 C 装柱 D 加试样 E 洗脱 F 检测器 G 部分收集器,柱层析系统的组成,柱层析装置图,7.1.2色谱分类,4)、

10、按展开程序 A)、洗脱法 B)、顶替法 C)、迎头法 5)、按原理分类,前沿法(frontal method)又称迎头法 如将含三个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱。 由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后是与固定相作用最强的第三个组分与第二个和第一个组分混合流出。,前沿法(frontal method)又称迎头法,此法仅第一个组分纯度较高，其他流出物皆为混合物，不能实现各个组分的完全分离，现已较少采用。,置换法(displacement method) 又称顶替法 当含三种组分的混合

11、物样品注入色谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一般流动相无法将他们洗脱下来。 为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂（或称顶替剂）作流动相，当它注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作用力的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个组分的纯品。,置换法现已在大规模制备色谱中获广泛应用，在生物大分子纯品制备中取得良好的效果.,7.1.2色谱分类,国际通用色谱法分类及其缩写,7.1.3色谱的名词术语,分配系数m： 式中，cs和cm分别为组份在固定相和流动相中的浓度。 分配系数m 类型： A、B型曲线是一条典型的吸附等温线，吸附色谱法属于这类曲线。 C和D型吸附等温线

12、很少遇到 C曲线为线性分配等温线。 线性色谱：溶质浓度低时，m为常数时的色谱,分配系数意义,溶质流过色谱柱时，m大的组份通过色谱柱所需要的时间长，m小的组份需要的时间短； 当样品中各组份在两相的m不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。,m大-时间长,7.1.3色谱的名词术语,A、基线： B、峰高：色谱峰顶与基线间的垂直距离，以h表示。 C、保留值： 死时间tm：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。因为物质不被固定相吸附，故其流动速度将与流动相的流动速度相近： 保留时间tr：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。 调整保留时间tr： .,7.1.3色

13、谱的名词术语,保留时间tr的表达： 时间单位(如s, d, h), 距离单位(如cm)， 体积(ml, l)表示。 tr意义： 色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。,7.1.3色谱的名词术语,D、死体积VM： 指色谱柱内 a固定相颗粒间所剩留的空间、 b色谱仪中管路和连接头间的空间 c检测器的空间 当后两项很小而可忽略不计时， Vm可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)的乘积计算：,E、保留体积VR： 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系： F、调整保留体积VR：某

14、组份VR扣除VM后，称该组份的VR ，即,7.1.3色谱的名词术语,G、相对保留值2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比，即： 由于2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。 因此，它是色谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。 注意：2,1绝不是两个组份保留时间或保留体积之比,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标值(s), 然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值。此时r,i 可能大于1，也可能小于1。 在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号a表示： 式中tr,2为下一峰的调整

15、保留时间，所以这时a总是大于1。,7.1.3色谱的名词术语,H)、分配比 k（即容量因子）： 意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数 k与m的关系：,7.1.3色谱的名词术语,4)、区域宽度 色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法： A、标准差：0.607倍峰高处峰宽的一半。 B、半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它与的关系为 C、基线宽度Y：色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距。它与的关系是,7.1.3色谱的名词术语,色谱曲线反映出的重要信息： A、根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的 最少数 ； B、根据色

16、谱峰的保留值(或位置)，可以进行定性分析； C、根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析； D、依据色谱峰的保留值及其区域宽度，评价色谱柱分离效能； E、色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。,7.2 色谱过程理论基础,两组份完全分离必须满足： A、两组份的分配系数必须有差异； B、区域扩宽的速率应小于区域分离的速度； C、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。,7.2 色谱过程理论基础,它不仅应说明组份在色谱柱中移动的速率，而且应说明组份在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。 塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。速率理论对色

17、谱分离条件的选择具有实际指导意义。 因此本节将重点介绍,7.2.2 理论板模型,塔板模型: 将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成。 每一块塔板高(plate high)为H。 假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为： n称为 理论塔板数 (theoretical plate number)。 与精馏塔一样，色谱柱的柱效 随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高H的增大而减小。,7.2.2 理论板模型,理论塔板数 n与半峰宽及峰底的关系式为: 式中 tr(或Y1/2) 应采取同一单

18、位(时间或距离)。 上式示：在tR一定时，如果色谱峰越窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。,7.2.2 理论板模型,在实际工作中，按上式计算出来的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以，常用有效塔板数n有效表示柱效： 有效塔板高为： 例1 已知某组分峰的峰底宽为40S，保留时间为400S，计算此色谱柱的理论塔板数。,7.2.2 理论板模型,例2 已知一根1米长的色谱柱的有效塔板数为1600块，组份A在该柱上的调整保留时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔板高度。 思考一下 ？,7.2.2 理论板模型,例2 已知一根1米长的色谱柱的有效塔板

19、数为1600块，组份A在该柱上的调整保留时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔板高度。,7.2.3 传质速率模型,1956年，荷兰学者范姆特（van Deemter）等人在研究气液色谱时，提出了色谱过程的动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中塔板高的概念，并同时考虑影响 塔板高 的动力学因素，指出：填充柱的柱效受分子扩散、传质阻力、载气流等因素的控制，从而较好地解释了影响塔板高的各种因素。 谱峰扩宽受三个动力学因素的控制，即涡流扩散，分子扩散项，传质阻力项。这样, 上述塔板高方程表示 式中，A、B、C为常数，分别代表分子扩散项系数、涡流扩散项系数和传质阻力项系数。由上式知，当一定，只有当A

20、、B、C较小时，H才能小，柱效才会高。反之则柱效低，色谱峰扩张。,7.3 分离度,柱效n 衡量柱效的指标是n (或neff)，柱效则反映了色谱分离过程的动力学性质。 选择性 为洗脱峰相临的两种溶质的容量因子之比.,分离度 右图是两相邻组份在不同色谱条件下的分离情况。 a）中两组份没有完全分离。 b）和c）中两组份完全分离，前者的柱效虽不高，但选择性好；后者的选择性较差，但柱效高。 由此可见，单独用柱效或柱选择性并不能真实地反映组份在色谱柱中的分离情况，所以，在色谱分析中，需要引入分离度(RS)这一概念。,7.3 分离度,分离度也称分辨度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比，即 当R

21、s 1.5时，两峰才能完全分离。 当然，更大的Rs值，分度效果会更好，但会延长分析时间。,7.3 分离度,利用上式，可以直接从色谱图上计算分离度。但该式没有体现影响分离度的诸因素。 而下式清楚地指出了，分离度受柱效n、选择性和容量因子k三个参数的控制：,k=mF,7.3 分离度,意义（3点）： 第一，增加塔板数，可以增加分离度，若通过增加柱长来增加塔板数，就会延长分析时间。 所以，设法降低塔板高H，才是增大分离度的最好方法。 第二，加大容量因子可以增加分离度，但是会延长分析时间，至造成谱带检测困难。 一般来说，当k 10时，分离度的提高并不明显；而当k 2时，洗脱时间会出现极小值。因此，在色谱

22、分离中，通常将k控制在2-7之间。,第三，选择性参数的微小增大，都会使层析分离度得到较大的改善。 当 2时，即使在很短的时间内，组份也会完全分离。 当 1时，要完成分离，必须增加柱长，延长分析时间。 例如，为了达到同样的分离度，当 = 1.01时，所需的时间是 = 1.1时的84倍。 显然，当 = 1时，无论怎样提高柱效，加大容量因子等，Rs均为零。在这种情况下，两组份的分离是不可能的。,定性分析,制备性色谱定性分析 特异性检测,定性分析,分析性色谱定性分析 1st 在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留时间。 2nd相对保留值2,1： .,定量分析,定量依据 在一定色谱条件下，组份i的

23、质量(mi) 或其在流动相中的浓度，与检测器响应讯号（峰面积Ai或峰高hi ）成正比： 式中fiA和fih是绝对校正因子。 峰高测量,峰面积测量 1st 自动测量： 2nd 手工测量：手工测量的有关计算峰面积公式为 对于对称的峰，近似计算公式为 对于不对称的峰的近似计算公式为 式中Y0.15和Y0.85 分别是峰高0.15和0.85处峰宽值. 峰面积的大小不易受操作条件如柱温、流动相的流速、进样的速度等的影响，从这一点来看，峰面积更适于作为定量分析的参数。,定性和定量分析,定量校正因子 1st 绝对校正因子 组份峰面积和峰高的 绝对校正因子分别为： 由此可见，绝对校正因子是指某组份通过检测器的

24、量与检测器对该组份的响应信号之比。 存在问题： 很明显，绝对校正因子受 仪器及操作条件 的影响很大，偶然误差和系统误差较多，故其应用受到限制。,解决之道：相对校正因子,定性和定量分析,2nd 相对校正因子 指组份i与 基准组份s 的绝对校正因子之比，即 式中fAis和fhis分别为组份的峰面积和峰高相对校正因子，fAs和fhs分别为基准组份s的峰面积和峰高绝对校正因子。 必须注意，相对校正因子同量纲(相当于同身寸尺)。 绝对校正因子很少使用，一般文献上提到的是相对校正因子。 优点：相对校正因子消除了偶然误差和系统误差较.,3rd 相对响应值 也叫相对应答值，即相对灵敏度，当计量单位相同时，它们

25、与相对校正因子互为倒数：,定量方法- 外标法(亦称标准曲线法),1st 作标准曲线： 该法是在一定色谱操作条件下，用纯物质配制一系列不同的浓度的标准样，定量进样，按测得的峰面积 对标准系列的 浓度 作图绘制标准曲线。 2nd 定量分析 进行试样分析时，在与标准系列严格相同的条件下定量进样，由所得峰面积从标准曲线上即可查得待测组分的含量。,定量方法- 外标法(亦称标准曲线法),3rd 优点 外标法的优点是操作和计算简便，不需要知道所有组分的 相对校正因子 ，其准确度主要取决于进样量的准确和重现性，以及操作条件的稳定性。 4th 存在问题 结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。,定量

26、方法-内标法,当试样中所有组分不能全部出峰，或只要求测定试样中某个或几个组分时，可用此法。 准确 称取 m (g)试样，加入某种纯物质ms (g)作为内标物，根据试样和内标物的质量比 ms/m 及相应的色谱峰面积之比，基于下式可求组分 i的百分含量 Wi%：,Mi带入下式,定量方法-内标法,1st 内标物的选择条件是： a、内标物与试样 互溶 且是试样中 不存在 的纯物质； b、内标物的色谱峰 既处于待测组分峰附近，彼此又能很好地分开且不受其它峰干扰； c、加入量宜与待测组分量相 近。 内标法的优点是定量准确，操作条件不必严格控制，且不象归一化法那样在使用上有所限制。 缺点是必须对试样和内标物

27、准确称重，比较费时。,不干扰,定量方法-内标法,2nd 优点 内标法是通过测量内标物及欲测组份的 峰面积 的相对值来进行计算的，因而可以在一定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差。 3rd内标法的缺点： 在试样中增加了一个内标物，这常常给分离造成一定的困难。,4th 内标法的条件 A、内标物必须是待测试样中不存在的； B、内标峰应与试样中各组份的峰分开，并尽量接近欲分析的组份。,定量方法-归一化法,如果试样中所有组分均能流出色谱柱并显示色谱峰，则可用此法计算组分含量。 设试样中共有 n 个组分，各组分的量分别为 m1，m2，mn，则 i 种组分的百分含量为：,定量方法-归一化法,优点是 简便

28、、准确，进样量的多少不影响定量的准确性，操作条件的变动对结果的影响也较小，对组分的同时测定尤其显得方便。 缺点是 试样中所用的组分必须全部出峰，某些不需定量的组分也需测出其校正因子和峰面积，因此应用受到一些限制。,应用: 违禁药物分析,样品准备 1st 100mg hair washed by 0.3% Tween 20 aqeous solution. 2nd hair was cut into small fragments incubated 12h in 2 ml 0.25M HCl 3rd the incubation mixture was neutralised by NaOH

29、4th solution was extracted into organic phase of 63% heptane + 19% dichloro-methane + 18% dichloro-ethane. 5th evaporated by a stream of air and the residue resissolved in a suitable solvent. Incubated培养 neutralised中和 residue残渣,dichloro-methane二氯甲烷 heptane庚烷ethane乙烷,7.4 凝胶过滤色谱,7.4.1 原理与操作 定义： 凝胶过滤 (

30、Gelfitration) 即凝胶过滤层析 (Gelfitration Chromatography)， 也称分子排阻层析 (Molecular-Exclusion)、 尺寸排阻 (Size Exclusion)、 分子筛层析 (Moleculai-Sieve Chromatography) ， 是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量 不同而进行分离的技术。,在层析柱中填充分子筛(凝胶)介质，加入待纯化样品，然后用适当缓冲液淋洗，使样品自上而下扩展。 大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间间隙扩展，下移速度较快；反之，小于凝胶孔径的分子，能自由出入胶粒内外，按照分于热运动规律

31、，其运动轨迹“迂回曲折”。因此，下移速度慢。 所以，样品通过一定距离的层析柱后，不同大小的分子就将按先后顺序依次流出，彼此分开。,7.4 凝胶过滤色谱,7.4 凝胶过滤色谱,分子筛凝胶色谱原理,Retard阻止,Size-exclusion chromatography,Desalting proteins 脱盐蛋白,proteins,salts,在装填具有一定孔径分布的凝胶过滤介质的层析柱中，料液中溶质1的相对分子质量很大，不能进入到凝胶的细孔中，因而从凝胶间的床层空隙流过，洗脱体积为层析柱的空隙体积； 溶质4，其相对分子质量很小，能够进入到凝胶的所有细孔中，因而其洗脱体积接近柱体积；相对分

32、子质量介于溶质1和溶质4之间的溶质2和3可进入到凝胶的部分细孔中，故其洗脱体积介于空隙体积和柱体积之间，根据相对分子质量的差别（溶质2的相对分子质量大于溶质3）顺序洗脱。相对分子质量大于溶质l和小于溶质4的溶质的洗脱体积分别与溶质1和溶质4相同。,GFC的分离原理 及洗脱曲线,7.4 凝胶过滤色谱,GFC操作中溶质的分配系数m 只是 相对分子质量、 分子形状、 凝胶结构(孔径分布) 的函数， 与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关，即在一般的层析操作条件下、相对分子质量一定的溶质的分配系数为常数。 因此，GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，这种洗脱法称为恒定洗脱法(isocrat

33、ic elution)。,GFC可分离系统体积介于V0和Vt之间的溶质，分离精度有限，料液处理量也很小，只有当料液体积小于两溶质的洗脱体积差，才有可能完全分离。,7.4 凝胶过滤色谱 凝胶层析的操作,（1）凝胶的处理 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶以干品出售的，所以在使用前必须溶胀。可以将它们浸泡在洗脱剂中，慢慢搅拌。 洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。这是因为大多数凝胶都含有少量羧基，如果洗脱剂的离子强度低于0.08，少量羧基不能被屏蔽，凝胶颗粒就具有离子交换性质，从而改变溶质的分配系数。,溶胀时不能用电磁搅拌器，这样会使颗粒损坏，产生大量粉末，影响流速。 溶胀要完全，否则影响层析的均

34、一性，甚至有使柱破裂的危险，加热可使溶胀加速。 溶胀时搅拌可能产生很细的颗粒，必须将其除去，否则会严重降低柱的流速。 琼脂糖凝胶如何溶胀？,是以浓的悬浮液的形式出售的，不需溶胀。,7.4 凝胶过滤色谱,凝胶层析的操作 （2）装柱 装柱前，柱的底部要先放些玻璃棉、玻璃细孔板等可拆卸的支持物，以支持固定相。 凝胶要悬浮在洗脱剂中，在搅拌下缓慢加入柱中，使凝胶自然沉积，直到所需高度为止。 床层要均匀，不能有纹路或气泡。 装柱时要考虑凝胶的承压能力，如压力太高，凝胶会被挤压变形而影响流速。,7.4 凝胶过滤色谱,（3）上样和洗脱 柱床经洗脱剂平衡后，在床顶部留下数毫升洗脱剂，再用滴管轻轻沿柱壁将试样加

35、入至柱的上面，防止扰动 填充层表面，打开柱底部的流出口，使样品液渗入凝胶床内。 当样品液面恰与凝胶床表面平时，加入数毫升洗脱剂冲洗管壁。这一步关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶表面干燥而发生裂缝。 用大量洗脱剂洗脱，并收集相应的洗脱液。,非水溶性物质的洗脱采用有机溶剂（如苯和丙酮），水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。 pH的影响与被分离物质的酸碱性有关，在酸性pH时碱性物质易于洗脱，在碱性pH时酸性物质易于洗脱。 多糖类物质的洗脱以水为最佳，有时为了使样品溶液解度增加而使用含盐洗脱剂。,7.4 凝胶过滤色谱,（4）凝胶的再生和保养 理论上因为凝胶本身不与

36、溶质发生作用，所以层析分离后无需再生处理，但实际操作时凝胶层常有一定的污染，必须作适当的处理。 交联葡萄糖凝胶柱可用0.2mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合液处理。 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶由于遇酸、碱不稳定，常用0.5mol/L NaCl处理。,为了抑制微生物在凝胶层内生长，在凝胶床保存之前必须完全除去 磷酸根离子 和 所有底物，将柱真空保存或低温保存，但温度不可过低，离子强度要高一些，以防冻结。 经常使用的凝胶以 湿态 保存为主，只要在其中加入适当的 抑菌剂 就可放置几个月至一年，不需要干燥。,常用的抑菌剂有：,叠氮钠 （0.02%）、 三氯丁醇 （0.01%0.02%

37、）、 乙基汞硫代水扬酸钠 (0.005%0.01%)、 苯基汞代盐 （包括、苯基汞代乙酸盐、硝酸盐、硼酸盐，0.001%0.01%）。,7.4 凝胶过滤色谱 7.4.2凝胶过滤介质,凝胶过滤层析常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。因此，良好凝胶过滤介质应满足以下要求： 亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用； 稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长； 具有一定的孔径分布范围； 机械强度高，允许较高的操作压力(流速)。,7.4 凝胶过滤色谱,Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。 Sephadex G是

38、利用葡聚糖(右旋糖酐)交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。 原料中环氧氯丙烷用量越大，交联度越高，凝胶的网状结构越紧密，吸水量越小。 Sephadex凝胶按交联度大小，分G10G200共八种型号。,7.4 凝胶过滤色谱,图7-7中曲线表示葡聚糖凝胶骨架。 图7-7交联葡聚糖网状结构 图7-8琼脂糖凝胶结构 琼脂糖凝胶是另一种较常使用的凝胶过滤介质，其骨架结构如图7-8所示。,7.4 凝胶过滤色谱,Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一，机械强度较低。 Sepharose CL是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。 除GFC外，琼脂糖凝胶经化学修饰后主

39、要用于离子交换层析、疏水性相互作用层析及亲和层析的载体。 除上述两种常用的凝胶外，聚丙烯酰胺凝胶也常使用。,7.4 凝胶过滤色谱,常用：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂糖凝胶、Sephacryl、Superdex等,7.4 凝胶过滤色谱,7.4.2.2 表征凝胶特性的参数 排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量。 分级范围：凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量。 凝胶粒径：粒径越小，HETP越小，分辨率越大。 空隙体积：色谱柱中凝胶之间空隙的体积。 溶胀率： 床体积：1g凝胶干粉充分溶胀后所占有的体积。,7.4 凝胶过滤色谱,7.4.3 影响分离特性的因素 线速

40、度 料液体积,凝胶过滤色谱影响操作的因素,线速度见书266页 料液体积见书268页,料液浓度 料液与流动相的黏度比小于2，以避免不规则的洗脱曲线（吐舌和拖尾）。 相对分子质量与分配系数的关系 ma-blogMr 凝胶粒径 小粒径凝胶是提供色谱柱效的最佳途径。粒径变小 ，那么 柱效 ， 分离度 ，分离速度都变大,7.4 凝胶过滤色谱,7.4.4 凝胶层析的应用及特点 7.4.4.1 分离纯化 GFC可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒(50 nm 400nm)的分离与分析中频繁使用的液相层析法。,GFC还可用于医药产业中无热原水的

41、制备以及低分子生物制剂中抗原性杂质的除去。 例如，青霉素的致敏作用般认为是产品中存在的一些高分子杂质所致，如青霉素聚合物和青霉素降解产物青霉烯酸与蛋白质相结合形成的青毒噻唑蛋白，它们都是具有强烈致敏性的抗原。 利用Sephadex G25凝胶柱处理青霉素溶液可除去这类高分子杂质,7.4 凝胶过滤色谱,高效GFC分离骨髓血清蛋白质的结果,7.4 凝胶过滤色谱,7.4.4. 2脱盐 GFC在生物分离领域的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分于质量物质。 例如，经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换层析分离，可首先用GFC脱盐。,此外，GFC还用于溶

42、解目标产物的缓冲液的交换。 生物物质的分离纯化需要多步操作，上一步操作所用缓冲液有时不适合于下一步单元操作的有效实施(例如，某些盐离子抑制蛋白质在亲和吸咐剂上的吸附)，必须进行缓冲液的交换。 若将缓冲液A换成缓冲液B，可先用B液冲洗GFC柱，上样后用B液洗脱，即可完成缓冲液的交换。,7.4 凝胶过滤色谱,7.4.4. 3相对分子质量的测定 GFC中溶质的分配系数m在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而线性减小，分配系数与相对分子质量Mr之间有： ma-blogMr 在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数(或洗脱体积)与相对分子质量的对数呈线性关系，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测

43、定。,首先用标准蛋白质 如细胞色素C(12500，指分子量，下同)、肌红蛋白(16900)、胰凝乳蛋白酶(23200)、卵白蛋白(45000)和血红蛋白(64500)等分别 进行凝胶过滤层析实验，确定分配系数与相对分子质量的关系式。 然后测定未知物质的洗脱体积(分配系数)，就可推算其相对分子质量。 不过，GFC仅对 球形分子 的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。,7.4 凝胶过滤色谱,7.4.4. 4凝胶层析的特点 与其他层析法相比，GFC的最大特点是操作简便，凝胶过滤介质相对价廉易得，适合于大规模分离纯化过程。 因此，GFC在生物大分子的分离纯化过程中应用最为普遍，尤

44、其被广泛应用子分离纯化过程的初级阶段以及最后成品化前的脱盐。,GFC的具体优点如下：, 溶质与介质不发生任何形式的相互作用。因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100； 每批操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；,7.4 凝胶过滤色谱,作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高，与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高； 分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。,与其他层析法相比，GFC的不足之处在于： 仅根据溶质之间相对分子质量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小； 经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作(如

45、超滤、离子交换和亲和层析等)后使用。,7.5.1 原理与操作 1离子交换层析的原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据 荷电溶质 与 离子交换剂之间 静电相互作用力 的不同而发生 差速迁移，从而实现溶质分离的洗脱层析法。,7.5 离子交换层析,阴离子交换基：DEAE(二乙胺乙基，通用范围：pH8.6），QAB (季铵乙基）； 阳离子交换基：CM(羧甲基，适用范围pH4)，P (磷酸基) 和 SP (磺丙基)。 各种凝胶过滤介质键合上述离于交换基，即可制备相应的离子交换剂。常用于制备离子交换剂的介质有Sephadex、Se

46、pharose、TSKget PW、Toyopearl、Bio-Gel A和纤维素等。,原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。,离子交换剂分离蛋白质的过程,平衡,吸附,去吸附,分离结束,再生,+,低盐,高盐,利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Ion-exchange chromatography,2离子交换层析的操作 离子交换层析的装置主要包括蠕动泵、离子交换层析柱、紫外检测器及部分收集器等。 进行离子交换层析时，先将树脂用

47、展开剂处理，使树脂层析剂转变成展开剂离子的型式； 然后将溶解在少量溶剂（通常为展开剂）中的试样加到层析柱的上部，再通入展开剂展开，流出液分步收集，测定其含量。 在分离制备中，根据检测结果，分段合并各步收集液，并进行浓缩提取。,7.5 离子交换层析,IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用： 流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(linear gradient elution) 或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(step wise elution)。,在线性梯度洗脱和逐次洗脱过程中，IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此区带后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。 GFC之外的层

48、析操作多采用线性梯度洗脱法或逐次洗脱法，只是流动相组成的变化情况各不相同。,7.5 离子交换层析,线性梯度洗脱法的优点是流动相离子强度 (盐浓度) 连续增大，缺点是需要特殊的调配浓度梯度的设备。 逐次洗脱法的优点是利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便. 哪个好呢？,141,逐次洗脱法 缺点是因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。 此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数 (如盐浓度，体积)的设计较困难。,综合上述两种洗脱法的特点，在实际层析操作中，如果料液组成未知，一般应首先采用线性梯度洗脱法，确定各种组分的分配特性以及层析操作的条件。 选择合

49、适的离子交换剂是操作关键，另外离子交换层析缓冲液的选择也很重要。 溶解样品的初始缓冲液离子强度要低，层析展开用的洗脱剂离子强度可升高。,7.5 离子交换层析,使用梯度洗脱时，离子强度逐渐增加。 阳离子交换剂的洗脱pH由低到高，阴离子交换剂的洗脱pH由高到低。 新的离子交换剂在初次使用前，常需预处理，离子交换剂使用过后，要再生处理。,膠体再生： 蛋白質全部溶出後，交換介質要經過 再生 (regeneration) 後，才能再次使用。 (2) 以12 M NaCl即可洗去雜蛋白，彻底清洗可用0.1 M NaOH洗；陰子交換介質可用1 M醋酸鈉 (pH 3.0) 洗1.5倍体積；再以緩衝液平衡完全，

50、才能再使用。 (3) 可測出液的pH或子濃，是否與加入的緩衝液一樣。也可把膠体取出，在燒杯或斗中澈底清洗。 大多失敗是由于 再生！,7.5.4 离子交换层析的应用及特点 如果说GFC主要用于生物产物的初步纯化和中后期的脱盐，则IEC是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段。这主要是由于IEC基于离于交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有通用性而且选择性远高于GFC。图7-10、7-11分别为IEC分离多肽和核酸的实例。,图7-10 激素多肽的IEC分离 图7-11 E coli RNA的IEC分离,7.5 离子交换层析,归纳而言，IEC具有如下的特点： 料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速

51、下操作； 应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短； 产品回收率高； 商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲和吸附剂。,7.5 离子交换层析,但是，IEC的操作变量远多于GFC，影响分离效果的因素非常复杂。 这种复杂性给目标产物的选择性高度纯化带来了机遇，同时也增加了过程设计和规模放大的难度。 小型层析柱的实验数据一般不能直接用于规模(包括柱体积和处理量)放大，必须实施必要的探索性实验。,7.6.1 原理与操作 1疏水性相互作用层析的原理 (Hydrophobic interaction chromatography，HIC) 是利用表面偶联弱疏水性基团(

52、疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性 相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。,7.6 疏水性相互作用色谱,亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸 (如酪氨酸、苯丙氨酸等) 含量较多的蛋白质疏水性基团多，疏水性也大。,尽管在水溶液中蛋白质具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性 和 荷电基团的作用，但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质表面。 这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相 ( 疏水性吸附剂 ) 所吸附。,Mechanism of HIC,（1

53、）疏水性吸附剂 各种凝胶过滤介质经 偶联疏水性配基 后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基(c3c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 因疏水性吸附作用与配基的疏水性(疏水链长度)和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基应较疏水性低的配基修饰密度低。,7.6 疏水性相互作用色谱,一般配基修饰密度在（1040）mo1cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作用不足，密度过大则洗脱困难。 疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶联主要利用氨基或醚键结合，形成图7-12中所示的各种疏水性吸附剂，其中R表示疏水配基。,图7-12 疏水性吸附剂 图中a的末端

54、氨基以及a和b的键合亚氨基显弱碱性，在中性pH范围内带正电荷，因此，这类疏水件吸附剂除疏水性吸附外，还可能存在静电吸附(离子交换)作用。 图中c的吸附剂利用醚键结合不引入荷电基团，对蛋白质仅产生疏水性吸附作用。,7.6 疏水性相互作用色谱,（2）影响疏水性吸附的因素 蛋白质的疏水性与其荷电性质相比复杂得多，不易定量掌握。 除疏水性吸附剂的性质（疏水性配基的结构和修饰密度）外，流动相的组成 以及 操作温度 对蛋白质疏水性吸附的强弱均产生重要影响。,7.6 疏水性相互作用色谱,（2）影响疏水性吸附的因素,离子强度及种类 a、蛋白质的疏水性吸附作用随 离子强度 提高而增大。 b、离子的种类亦影响蛋白

55、质的疏水性吸附。 高价阴离子的盐析作用较大。疏水性吸附与盐析沉淀一样，在高价阴离子的存在下作用力较高。,因此，HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。,破坏水化作用的物质 离液离子(chaotropic ion) ：SCN-、CLO4-和 I- 等离子半径较大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子之间相互作用。 反离液离子(antichaotropic ion)：盐析作用强的高价阴离子(如SO42-，HPO42-等) 增强水分子之间相互作用。,影响疏水性吸附的因素,离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗

56、脱。 除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱促进剂，洗脱时疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱高疏水性蛋白质。,表面活性剂 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。 根据这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗脱分离。 但选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜： 浓度过小则蛋白不溶解， 过大则抑制蛋白质的吸附。,影响疏水性吸附的因素,2疏水性相互作用层析的操作,吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。 为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上，选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温度 因素。,为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法： 改换一种具有较低盐析效应的离子； 降低离子强度； 减弱洗脱剂的极性，也可加入乙二醇； 用含有表面活性剂的洗脱剂； 提高洗脱剂的pH。,再生 每次实验结束后，吸附剂需要再生。 因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附容量将明显降低。 一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使