荧光定量PCR仪操作指南eppendorf.doc

1、目录：1 安全预防法2 安装2.1 交货包装2.2 仪器的安装2.3 功能性单元2.3.1 Mastercycler ep realplex2.4 启动2.4.1 realplex模块与热模块之间的连接2.4.2 Mastercycler ep realplex 与计算机之间的连接2.4.3 与其它部件的连接2.4.4 realplex软件的安装2.4.4.1 安装主程序2.4.4.2 数据恢复2.4.4.3 开始realplex软件的运行3. 操作3.1 管理者登陆3.2 登陆3.3 用户变更3.4 系统配置3.4.1 对使用者的管理3.4.1.1 新用户建立3.4.1.2 编辑用户3.4.

2、1.3删除用户3.4.2 用户层3.4.3 循环仪3.4.4 realplex 模块3.4.5 系统层3.4.5.1 特性3.4.5.2 登陆出错信息3.4.5.3 用户登陆3.4.5.4 软件更新3.5 检测项目管理3.5.1 建立检测项目3.5.2 打开检测项目3.5.3 保存检测项目3.5.4 保存模板文件3.5.5 模板文件的使用3.5.6 复制检测项目3.5.7 检测项目的输出3.5.8 检测项目的输入3.5.9 建立文件夹3.5.10 删除检测项目和文件夹3.6 探针管理3.7 染料管理3.8 校准3.8.1 背景校准3.8.2 颜色校准3.8.2.1 使用商业的校准工具包进行的颜

3、色校准3.8.2.2 客户特有的染料的校准3.9 数据库管理3.9.1 当前数据库的自动保存3.9.2 当前数据库的保存3.9.3 输入数据库3.9.4 数据库的归档4 编程（检测项目的建立）4.1 建立一个新的检测项目4.2 建立板布局4.2.1 染料的确定4.2.2 参考染料的选择4.2.3 样本容积输入4.2.4 探针类型的确定4.2.5 背景的确定4.2.6 样品类型的定义4.2.6.1 标准4.2.6.2 阳性对照4.2.6.3 阴性对照4.2.6.4 未知样品4.2.7 复制和标准系列的自动建立4.2.8 定量的样品类型4.2.9 相对定量的样品类型4.2.9.1 多plex分析例

4、子4.2.9.2 单plex分析的例子4.2.10 熔点分析中的样品类型4.2.11 终点测定中的样品类型4.2.12 +/-检测项目中的样品类型4.2.13 基因辨识中的样品类型4.2.12 样品的复制与剪切4.2.15 删除样品4.2.16 几个样品的归组4.2.17 子检测项目的测定4.2.18 板布局的删除4.2.19 完整检测项目的板布局编辑4.3 pcr程序的建立4.3.1 用模板程序建立一个pcr程序4.3.2 不用模板程序建立pcr程序4.3.3 程序步的插入和编辑4.3.3.1 温度4.3.3.2 循环（15步循环）4.3.3.3 保温4.3.3.4 暂停4.3.3.5 声音

5、4.3.3.6 熔解曲线4.3.3.7 终点4.3.4 程序的复制4.3.5 程序的删除4.3.6 测量点的确定4.3.7 热盖设置5 操作（监测）5.1 样品的加载5.2 模块温度控制5.3 样品体积5.4 启动检测项目5.5 单个样品的选择5.6 单个样品类型的选择5.7 循环仪状态5.8 当前运行检测项目的中断5.9 继续运行检测项目5.10 终止检测项目5.11 mastercycler ep realplex 作为pcr的 使用5.12 mastercycler ep realplex 作为荧光计的 使用5.13 关闭6 分析6.1 概要6.1.1 打开检测项目6.1.1.1 打开在

6、运行的检测项目6.1.1.2 打开子检测项目6.1.2 单一检测项目的选择6.1.3 使样品处于不活动状态6.1.4 样品类型的选择6.1.5 分析模式的选择6.1.6 图标缩放6.1.7 存储默认设置6.1.8 图表的保存和复制6.1.9 样品数据的保存和复制6.1.10 编辑报告6.1.10.1 模板报告的应用6.1.11 分析的保存6.1.12 调用分析6.2 定量6.2.1 阈值确定6.2.2 基准线测定6.2.3 标准曲线6.2.4 分析6.2.5 multiplex 分析6.3 相对定量6.3.1 阈值的测定6.3.2 多plex 分析的估算6.3.3 单plex分析的估算6.4

7、熔解曲线分析6.4.1 阈值的测定6.4.2 分析6.5 终点测量6.5.1标准曲线6.5.2 分析6.6 +/-检测项目6.6.1 将终点测定作为数据源的+/-检测项目分析模式6.6.1.1 阈值的测定6.6.2 pcr数据作为数据源的+/-assay6.6.2.1 阈值测定6.6.3 分析6.6.4 多plex分析6.7 基因测定6.7.1 阈值测定6.7.2 分析7 维护7.1 清洁仪器的一般方法7.2 热模块的清洁7.3 热模块的验证与校准8 故障查找8.1 一般故障8.2 在sybr绿色分析中发生的错误8.3 qrtpcr过程中发生的错误9.1 登陆9.2 新用户的建立9.3 创建一

8、个检测项目9.4 检测项目的保存9.5 执行检测项目9.5.1 概述9.5.2 板布局9.5.3 pcr程序9.5.4 开始检测项目9.5.5 当前运行检测项目的中断9.5.6 继续运行检测项目9.5.7 退出检测项目9.5.8 分析10 技术数据2.3 功能性单元2.3.1 Mastercycler ep realplex图1：关闭的realplex模块前面观1 realplex模块2 状态显示3 密封压板（锁住状态）4 控制面板的挂钩（Mastercycler ep realplex不需要）5 热模块图2：打开的realplex模块前面观1 密封压板（开启状态）2 realplex模块3

9、热模块放入试验样本后，向前拉动realplex模块，覆盖住插入的试管。然后用压板密封，程序开始启动。注意在把密封压板归位时小心不要弄伤手指。当realplex模块开启时，不要触碰盖子下端以防被灼伤。2.4.4.3 开始realplex软件的运行打开mastercycler ep realplex的开关，等待位于开关上部的LED灯将变为绿色。现在您可以开始运行realplex软件了。您也可以在mastercycler ep realplex处于关断状态下运行realplex软件，甚至在不接任何硬件的状态下运行该软件。第二种情况下，软件将会提示一条错误信息，可以忽略该信息继续运行软件。注意：当使用

10、realplex软件时，不要运行其它会占用计算机大部分内存的软件（如：CD创建器或者媒体播放器等）！决不可以使计算机工作在电池供电模式！调整计算机供电电源的设定值以保证在程序运行过程中，计算机不会进入待机状态。3. 操作3.1 管理者登陆当realplex软件第一次被打开时，将会显示如图3.2所示的一个登陆对话框，提示软件管理者为Eppendorf命名并输入登陆密码。这项是仪器的出厂设置，如有需要用户可以在User Administrator对话框中对此项进行修改（详细情况请查阅3.4.2节）。此后软件再次被打开时，无论软件管理者还是其他的软件使用者，都必须建立一个用户才能登陆使用realpl

11、ex软件。3.2 登陆在打开程序时，Mastercycler ep realplex用户都必须先登陆才能进一步使用软件。所有用户名都列在选取框中。我们要做的就是选出自己的用户名并输入相应密码。新用户由软件管理者建立。（请参阅3.4.1.1节）如果登陆密码输入错误，则会显示登陆失败（login failed）。点击OK键确认后，重新进入登陆程序。如果点击Cancel键，则显示主屏幕（情参阅3.3节）。但是此时所有的功能键都会处于无效状态。为进入工作状态，使用者必须再次打开登陆对话框（情参阅3.2节）完成登陆手续。注意：登陆以后，用户可以对自己的文件夹和分析程序进行读或者写的操作，与Masterc

12、ycler ep realplex仪器连接后可以执行其他的实验操作。而对软件其他用户的文件夹和分析程序只有读的权限。如果想要执行或编辑其他用户的分析程序的话，可以将其复制到自己的文件夹中。3.3 用户变更当已有其他使用者登陆时，可以按照以下方法登陆系统： 通过点击该图标以退出登陆。 如果选择登陆图标，User login对话框将被弹出，使用者可以按照3.2节中描述的登陆步骤进行登陆。以上两种功能也可以通过File菜单来实现。软件在同一时刻仅允许一名用户登陆，新用户的登陆将自动使原来的使用者退出系统。当前登陆用户将被显示在屏幕下方的状态栏内。登陆后，主屏幕显示为Administror或者User

13、。主屏幕包括向导区，工作区和状态区。如果在左边的向导栏内选定某一程序函数时，该程序函数则会显示在工作区内，而状态栏中将显示热模块的状态信息和当前使用者的用户信息。1 菜单栏2 工具栏3 向导区4 工作区5 状态栏 通过选项show/hide navigator，向导区可以被显示或者隐藏。这一操作也可以通过setup菜单实现。注意：所有的对程序各个功能的操作以及对系统配置的操作，都可以通过工具栏或者菜单栏实现。选择性的操作还可以通过点击鼠标右键来实现。3.4 系统配置在setup菜单中选择system configuration项，则在菜单栏中显示realplex system configur

14、ation对话框。其中对话框左边列出了所有的使用者名单以及处于连接状态的模块名单，此外还有系统设置及其功能的结点选项。在向导栏内不同的层次显示为不同的符号。当用光标选中某个结点时，从属文件夹将变为可见的，再选一次则可关闭该结点。如果某层或其从属文件夹被选中，将在对话框的右边显示出相应的窗口内容。3.4.1 对使用者的管理当选中User项，User Administration图表显示在对话框右边，列出所有的用户名单。软件管理者登陆系统以后，可以使用该对话框进行建立新用户，编辑和删除已建立的用户的操作。3.4.3 循环仪在cycler结点处，可以得到已连接的循环仪的信息。设备特性被列在prope

15、rties图表下。此外相应硬件的资料以及最后登陆的用户名，还有最后运行的程序都会在此栏下显示出来。在incubate和lid图表下，可以调整热模块和加热盖的温度值。具体做法为首先在new temperature一栏中填入所需的温度值，然后选择incubate复选框以确认。如停止调温，则释放incubate复选框。PCR程序文档信息在protocol图表下显示。首先给出了启动PCR程序的登陆用户的信息以及该PCR程序的程序名和启动时间。接下来是相关的程序特性信息和热盖设置。除此之外，程序的运行各步骤也会在此显示出来。如果选中这个功能键，则原始记录将被作为txt文件保存。如果选中这个功能键，则原始

16、记录将被与计算机相连的打印机打印出来。在Cycler结点处双击鼠标，System结点就会显示出来，其中包含有模块的特性信息。特性：properties栏中显示出模块的型号以及热模块的序列号，同时热模块被最后验定和校定的信息也会显示出来。Sensors：显示当前传感器的温度值。温度验定：通过温度传感器对仪器的温度值进行测量，属于仪器温度验定系统的一部分（请详见命令信息）。该过程在温度验定系统的操作手册中有具体描述。温度校定：借助于温度传感器，对仪器的温度值进行的调整操作。其性能在温度验定系统的操作手册中有具体描述。3.4.4 realplex 模块在realplex module结点下将显示re

17、alplex模块的特定的系统信息。除了显示mastercycler ep realplex仪器的版本信息和软件的版本信息以外，其他装配件的序列号也会在此显示出来。同时还有滤波器设备资料和光电倍增器所选电压值。Realplex module还会指明设置realplex模块的CAN总线地址以及热模块和realplex模块之间是否是通过CAN总线电缆相连的。Cover state一栏中显示出加热盖的当前位置。在realplex module结点处双击鼠标左键打开下层各结点。Module log文件目录下记录了程序运行中出现的所有出错信息。这一图表中的出错信息可以通过选中save功能键以txt格式保存

18、下来，或者选中print功能键通过已连接的打印机打印出来。3.5 检测项目管理在工具栏中可以实现以下的检测项目的管理功能：1 新检测项目2 打开检测项目3 保存检测项目4 打印报告5 将文件输入当前的选中部分6 将当前的选中部分输出注意：以上提及的各个功能还可以通过file菜单，或者把鼠标放在向导栏中点击右键来实现。3.5.1 建立检测项目 当选中new assay图标时，将出现一个空白的板块，标准的pcr程序将在工作区内被装载。3.5.2 打开检测项目 当选中open assay图标以后，将弹出检测项目对话框：如果一个用户或者文件夹处于选中状态时。除了文本名、建立时间和更新时间会在assay

19、s面板上显示出来以外，所有保存其中的检测项目也都会在右边显示出来。而且还会提示出各文本的状态。 标有setup的文本代表从没被打开过。打开文本时，文本将被装载在assay setup和analysis中，而且在analysis中没有数据资料。 标有template的文本可以作为建立新文本的模板文本使用。更多相关信息请详见3.5.4和3.5.5节的关于模板文本的建立日期和使用的介绍。标有complete的文本代表数据获得已经发生过的文本。如果这样的文本被打开，数据将会显示在analysis下。并且除非有其它文本当前正在被运行的情况下，该文本才会显示在assay setup中。详见6.1.1.1节

20、中的介绍。当某个文本被选中，该文本中保存的所有分析数据都将被显示在下方的analysis窗口中。数据建立和执行这些分析的用户名都会被在这里列出来。因为断电或者系统发生错误等原因造成失败的文本都带有这个aborted的标志。如果在发生失败前获得了足够多的数据，那么该文本还是可以被拿来分析的。3.5.3 保存检测项目检测项目可以由登陆用户在他的结点下或者文件夹中执行保存操作。只有登陆用户才能执行对这些程序文件的编辑操作。而其他使用者只能对这些文件执行读或者复制的操作。当save assay的图标被选中后，当前的检测项目被执行保存操作。当要把一个检测项目保存在某目标文件夹下时，可以选中file菜单下

21、的save as功能键，打开相关对话框来实现。输入检测项目名后，文本通过复选框assay type被选中，点击ok以确认。3.5.4 保存模板文件当一个检测项目要在被创建以后多次重复使用时，该文件将被保存为模板文件。具体方法为在保存文件的过程时，复选框中选择template栏。3.5.5 模板文件的使用当创建简单的新检测项目时可以用到模板文件。具体方法：模板文件在assay setup通过功能键open assay中被装载，以检测项目的形式，命名后保存在用户结点下。3.5.6 复制检测项目用户可以复制其它用户的文本到自己的文件夹,对这些文本与模板进行启动和编辑。具体方法为：在assay对话框中

22、使用open assay选中和打开其他用户文件夹下相关的检测项目，然后通过save as将文本复制到自己的结点下（请查阅3.5.3节）。这时用户就可以在连接mastercycler ep realplex以后，直接启动和执行复制的检测项目了。3.5.7 检测项目的输出检测项目的输入输出功能用于几个工作站之间的文本交换。在此检测项目与板布局、PCR程序和被测数据一同被输入输出。 图标export assay to file用来以ASY格式保存当前的检测项目到另一个工作站上的计算机上以便对文本做更多的处理。在窗口的靠上一栏中选出检测项目的保存位置，然后输入文本的名字，并在file type一栏中选

23、择realplexexchange（*.asp）。3.5.8 检测项目的输入 当选中图标import assay from file时，一个格式为ASY的检测项目就会被装载到一个空白的文本中。当输入一个检测项目时，必须在窗口的靠上一栏内选中一个相关的保存位置，文件类型为realplexexchange（*.asp）。3.5.9 建立文件夹登陆用户可以在本人用户结点下建立文件夹，相关的文件和文本都在这个文件夹中保存，以方便日后的调用。根据如下的步骤建立文件夹：通过图标open assay打开检测项目的对话框。 选中本人用户结点后，通过功能键new来添加一个新的文件夹。 可以首先通过选中文件夹，然

24、后再点击功能键rename来重新命名。然后检测项目就可以在建立的文件夹中进行复制和创建等操作了。（请查阅3.5.4和3.5.2节）3.5.10 删除检测项目和文件夹通过图标open assay，用户可以在检测项目对话框中，点击功能键delete来删除选中的检测项目，最后点ok确认删除操作。同样的删除操作可以用来删除文件夹。 选中一个检测项目或者文件夹后，可以通过点击功能键delete，和确认yes来删除该检测项目或者文件夹。3.6 染料管理 选中dyes图标后，将会弹出相应对话框。这个对话框用于实现对染料的管理。在荧光测量中，染料是必须被适当设定的。相应染料的最大发射波长对于用户选择适当滤光片

25、(如FAM520nm与一号滤光片520+/-5 nm ）滤光片是非常重要的。请向各自的生产商咨询所需染料的最大放射量。注意：在执行颜色校准（请查阅3.8.2节）前，必须先定义相应的染料。 染料名称 染料最大的发射波长，单位为纳米（nm） 染料检测通道。基于特定的染料波长有程序预先自动设定。 具体染料校准时的光电倍增器的敏感度。包含有四位数码，用来为四个滤光片中的每一个设定相应数值（1代表低敏感度，9代表高敏感度）。该数码由软件预先设置。 最后一次执行染料校准的用户 最后一次校准时间。 在点击此键以后所显示的对话框中，新染料的所有数据都可以在这里输入进来。这个对话框用来输入新染料的名称和检测新染

26、料的滤光片。滤光片必须与新染料的发射波长相匹配。 当前染料的所有数据都可以在点击此键以后显示的对话框中修改。按ok以确认。 点击此键后，选择yes确认删除的染料。注意：如果染料的滤光片发生改变的话，将会失去染料的校准资料。3.8 校准在使用mastercycler ep realplex做荧光试验时，需要事先进行背景和颜色校准。校准应和随后的试验处于相同的温度下。注意：为保证密封盖上没有液体，溶液内没有空气泡，校准前应首先对校准板进行离心操作。一定要确保没有液体蒸发，否则使用新的校准板。在校准前，要保证仪器已经启动了至少15分钟。注意：软件会自动确定每个染料和滤光片所需的光电倍增器敏感度。所以

27、用户无需有任何输入。背景校准必须要在颜色校准之前执行。3.8.1 背景校准选中菜单栏setup后，就会弹出background calibration对话框，列出所有保存的背景校准。该列表还列出了校准时间和执行校准的用户名。除此之外还显示了背景校准的状态。 使用的板名称 作为默认设置的背景校准，带有十字标记。 光电倍增器的敏感度在染料校准过程中以四位数码的形式被确定下来。四个滤光片中，每个滤光片都对应确定一个数码（1代表低敏感度，9代表高敏感度）。这四个数码由软件预先设定。 执行背景校准的日期 执行背景校准的用户 一个新的背景校准过程会在点击该栏后出现的对话框中进行。 对话框new被打开后，输

28、入背景板的名称。 在右边的对话框的incubation栏中，输入模块和盖子的温度值。模块温度的缺省值为60摄氏度，盖子温度的缺省值为105摄氏度。 插入背景板以后，单击功能键calibrate开始执行校准，单击ok键确认操作。 在加热和第一次读值完成后，软件会提示翻转背景板，请按照软件的提示操作，翻转背景板，单击ok确认操作。 如果背景校准成功完成的话，背景板会显示出96个绿色位置的板布局。单击ok确认以关闭“校准成功完成”提示框。如果背景板在校准过程中的某些位置校准失败时，单击cancel来放弃校准数据。在这种情况下，前次的校准数据将被用来使用。选中proceed键时，背景校准数据在任何情况

29、下都会被排除。 在显示的对话框内，可以改变当前背景校准的所有的数据，然后校准过程被重复进行。前次的背景校准的数据将被覆盖。 当选中功能键default时，对于所有的检测项目来说，校准都为默认设置。此时在背景校准列表中，将显示一个十字标志。 点击yes来确认对背景校准的删除。背景校准失败的另一个原因可能是热模块内一些容器内的荧光污染造成的。热模块的清洁请详见7.2节。3.9 数据库管理所有的数据、设置值、用户结构都自动保存在数据库中，推荐用户定期为数据库建立备份。注意：不要混淆不同器皿的数据库。Database tool软件可以用来管理数据库。 双击图标database tool后，显示出rea

30、lplex database administration对话框。上面的selected database面板显示出当前数据库和其当前状态。Datebases and Archives图表显示了所有可用数据库的列表。共有两种形式的数据库： 实际使用的数据库，其中的数据都是当前存储的。数据库的名字由数据和数据库开始使用的日期组成。在selected database面板中，数据库被打开后，显示为绿色。 档案文件数据库都处于只读状态，储存以前的数据。这种数据库由档案和建立数据库的日期组成。在selected database面板中，随着数据库的被关闭，数据库显示为红色。如果在列出的数据库中选中其中

31、一个时，这个数据库将显示在selected databases面板中，并且与realplex软件连接起来。 如果选中功能start realplex的话，realplex软件会被直接打开。3.9.1 当前数据库的自动保存打开realplex软件后，一个备份将以一个正式基本形式自动在目录C:programseppendorfrealplexsecurity中被保存。关于自动保存的一些设置可以在图表configuration中进行。注意：只有管理者用户才有权力使用图表configuration设置自动保存。注意：当建立的自动备份超过十个时，最先建立的那个备份将被自动删除。因此，推荐定期建立备份。这

32、些备份应该保存在磁板或者服务器上。3.9.2 当前数据库的保存当前数据库副本的保存可以在图表backup database中进行。这一备份包含所有的数据和设定，其中包括检测项目、模板文件、校准数据和用户结构。面板显示了哪一个数据库要进行备份和在图表databases中选中的数据库。通常来讲，备份都是针对数据库和档案文件操作的。备份的名称由软件自动给出。根据源文件，名称可以是数据备份或者档案备份和建立数据。 当选中图标browse时，对话框set backup file name就会显示出来。当前的数据库将被赋予名称，点击功能键save，将该数据库以gbk形式放置在backup面板上提示的目录下

33、。注意：为了realplex软件可以成功识别数据库，需要根据源文件，在每个备份前加上backup_data或者backup_archive。 当点击start backup功能键时，在目录C:programseppendorfrealplexbackup下，建立一个备份文件。该过程被记录在图表log中。备份被自动保存在目录C:programseppendorfrealplexbackup下。该目录可以在图表configuration中被修改。如果计算机是一个网络中的其中一台的话，建议将此目录设置在服务器的目录之下。注意：只有管理者用户有权进入图表configurations（详见3.9.4章内

34、容）。3.9.3 输入数据库在realplex软件中，如果要将原来的数据库的备份激活，当前数据库必须被替换成一个备份文件，具体做法为首先在图表restore database中选中备份文件。 点击图标browse后，显示open backup files对话框。点击功能键open后，将在图表restore database中加载以gbk形式保存的数据库。 点击功能键start restore以后，数据库从目录C:programs realplexbackup中被加载进来。该过程将被记录在图表log中。注意：包含有检测项目，设定值，校准数据和用户结构的所有数据会被该数据覆盖。建议在此之前先建立一

35、个当前数据库的备份。为了作为实际使用的主数据库，使用一个已保存的数据库时，要确保所有的校准数据还是有效的。注意：也可以对一个档案文件备份的数据库进行恢复操作。在备份在图表restore database中被加载后，激活复选框create main database from archive执行恢复操作。建议在此之前对当前数据库建立一个备份。所有具有管理者权限的用户都可以管理数据库。在组合框内选中自己的用户名后，输入用户密码，并按ok确认（请查阅3.9.4节）。用于realplex软件的密码在此同样是有效的。3.9.4 数据库的归档当数据库大小超过大约250MB时，打开realplex软件时，用

36、户将被提示对数据库进行归档操作。归档后，用户可以以一个新的数据库继续工作，该数据库中包含有所有有关模板文件的设定、校准数据和用户结构内容。只有具有管理者权限的用户可以进行数据库管理。在组合框中选中用户名后，输入密码并按ok确认。用于realplex软件中的密码在此同样有效。用户登陆后，可以打开create archive图表。面板中显示了将要被进行归档操作的数据库，在表databases中选中该数据库。归档名称有软件自动建立，包含有backup_archive和建立日期。 选中功能键start archiving后，在目录c:proguammeeppendorfrealplexbackup下建

37、立一个档案文件。该过程将被记录在表log中。4 编程（检测项目的建立）mastercycler ep realplex软件基本上包含有两个模块：assay setup和analysis。模块assay setup被分为如下三个子项目：plate layout（板布局），pcr程序和监测系统。前边两个子项目用于检测项目的编辑，而在监测系统之下，运行的检测项目可以被在线的监测。模块analysis将在本书第六部分中被具体阐述。注意：各自使用不同检测项目的两个模块可以并行操作。即当其中一个检测项目正在运行时，另一个已完成检测项目的分析可以同时进行。（请查阅第6章）4.1 建立一个新的检测项目新的检测

38、项目可以通过点击file菜单下的new assay项建立。在左边窗口的向导栏中，初次显示的新建检测项目没有名字，带有从属项板布局（plate layout），pcr程序（pcr program）和监测（monitoring）。如果从属项其中的一项被选中后，新建检测项目显示在右边的工作区内。另外，通过菜单项commands功能键，不同的模块也可以被加载到工作区。打开软件后，作为默认设置，在工作区内存在一个可用的空白的板布局。4.2 建立板布局为建立一个板布局，选中向导栏左边的plate layout。可以看到右边的pcr板的96个位置。为了对其进行编辑，首先要确定被检测的染料。为了方便用户，后续

39、操作的各条指令显示在与工作区相邻的右下方的hints区内。为建立板布局，如下的工具栏内的各个功能都是有效的。1 清理板2 未知3 标准4 阳性对照5 阴性对照6 删除样本7 组成复制组8 拆分复制组9 建立子检测项目10 删除子检测项目11 板布局的编辑模式注意：另外，以上各个功能还可以通过菜单项目plate layout或者鼠标右键来实现。4.2.1 染料的确定在此，在带有相关滤光片的filterdyes面板上，染料通过组合框被选中。如果所需染料不包含在选项中，必须首先将其添加在菜单栏setup（请查阅3.6节）下的列表和校准该染料的仪器中。（请查阅3.8.2节）。如果realplex软件与

40、mastercycler ep realplex2相连，那么580nm滤光片和605nm滤光片不会显示在面板上。4.2.2 参考染料的选择参考染料可以在reference dye面板中通过组合框选择。但前提条件是该染料的颜色校准已经执行过了，而且该染料已经在filterdyes中被选好了。没有染料被默认选中。4.2.3 样本体积输入在工作区面板的右上端的sample vol中输入样本的体积。虽然这项输入并不是必须的，但是为了检测项目文件编制的完整，建议完成该项输入。4.2.4 探针类型的确定在板布局面板的右上端，通过组合框选择探针类型。如果所需探针类型不包含在选项内，必须首先在setup下添加

41、其到probes列表中。（请查阅3.7）。注意：探针类型的定义不是一定必须的，因为它对pcr程序中的测量点没有什么影响。但是为了检测项目文件编制的完整，建议完成该项输入。4.2.5 背景的确定在板布局面板的右上端，通过组合框选择背景的相关板类型。这也是执行检测项目所需的板类型。如果所需的板类型不包含在选项内，必须首先执行该背景的校准。4.2.6 样品类型的定义在板布局中选中一个或更多位置，在被打开的相关对话框中编辑，并在随后出现的工具栏中的，通过图标选择不同的样品类型。以上板布局编辑功能也可以通过鼠标右键或者菜单plate layout项实现。当各项输入完成后，带有样品类型、样品名称和samp

42、le表中的位置等数据的样品就会显示在左边窗口内。在右边窗口的sample info中，列出了板布局选择样品的各数据。4.2.6.1 标准 当图标standard被选中后，出现相关的对话框。1 在板布局中样品的位置2 样品名称3 目标基因选项的复选框4 目标基因名称5 检测目标基因使用的染料6 标准浓度单元7 标准浓度8 内部阳性对照（ipc）选项的复选框9 内部阳性对照（ipc）染料选项的组合框10 样品类型符号在这里，各数据和待检测目标基因都以标准名称输入。同时，在相关区域内，必须明确用量和浓度的标准。指数值的标准输入，例如：1E8。单位copies以及用量1都是默认设定的。可以通过auto

43、 series功能来建立标准系列。（请查阅4.2.7）注意：在这个对话框里可以进行编辑的目标基因的数量取决于在板布局中选择的染料的数量。4.2.6.2 阳性对照 选中position control图标以后，将出现如下的对话框。除了对照的名称和目标基因的数据以外，在此也可以定义基因识别（gene identification）分析模式下，作为等位基因的阳性对照。首先需要完成作为等位基因的阳性对照的编辑。在analysis下进行随后的识别时，对话框里每个等位基因都被自动分配一个颜色。也可以在amount栏内输入数值。但这在随后的分析中不是绝对必要的。4.2.6.3 阴性对照 当选中negativ

44、e control图标后，相关对话框被打开。在此对话框中只输入阴性对照的名称和目标基因数据。4.2.6.4 未知样品 当unknown图标被选中后，如下的对话框被打开。除了未知样品名称和目标基因数据以外，通过功能键auto series还可以在此编辑复制。（请查阅4.2.7节）在对话框的下端包括use of target gene(s) as面板和relative quantification/gene expression面板：use of target gene(s) as：可以通过一个内部阳性对照或者选定相关功能键作为持家基因设定目标基因，然后用组合框确定各自的染料。分析中由内部阳性对照

45、或者作为持家基因设定的基因被加亮为黄色。Relative quantification/gene expression：在此目标基因被定义为relative quantification/gene expression分析模式下的校准器。对于monoplex分析，通过组合框well with housekeeping gene(monoplexing)持家基因的孔可以与样品关联。4.2.7 复制和标准系列的自动建立当样品类型为标准（standard）和未知（unknown）时，可以自动建立复制。在编辑标准时，也可以自动建立标准系列。首先在要建立标准系列和复制的板布局内至少选择两个位置。 为化简

46、标准系列和复制的建立，使用new standard对话框。其中包含有auto series项。注意：只有当板布局中超过一个位置被选中后，该功能才能被激活。扩充对话框指明了板布局中被选中的位置，被分为复制和稀释两个区域。复制：在编辑框中输入复制的数量，另外，该项也可以用来定义板内复制布置形成基准的形式。相关复制可以布置成水平相邻或者垂直相邻的形式。以不同的方向，不同的复制可以相邻的排成行或者列。为说明的目的，形式显示在窗口preview中。稀释：使用编辑框来明确稀释元素和稀释步骤数。通过组合框order可以明确采用升序还是降序。在preview calculated amounts栏中，通过组合

47、框选中一个染料，根据在目标基因中定义的浓度初始值，显示浓度最终值。注意：这个区域在unknowns扩充对话框中处于不活动状态。点击ok确认该对话框后，在被选区域内建立起与参数数量相同的组数。当用未知样品建立复制时，整个被选区域被填满。样品名称和所有相关的数据都被自动分配。对应标准系列的单一标准的浓度数据也被自动显示在板布局中。4.2.8 定量的样品类型为了定量样品中的初始核酸，要用一个未知的初始核酸量从样品中建立起一个标准曲线。为了这样的目的，首先编辑板布局中的标准，然后编辑未知样品。阴性对照也要编辑。编制标准系列的例子：目标是建立一个10100000拷贝的三重复制子的标准系列，复制布置为彼此

48、相邻以行排列。拷贝的最高数量放置在位置A1C1上，稀释系列采用降序，水平列，每步稀释10倍。 在板布局中选择区域A1E3 打开standard对话框，其中包含附加auto series项。 输入参数 点击ok确认输入。使得板布局为：未知样品复制编程例子：目标是定义未知样品三重复制子目标基因，三倍复制被相邻放置在位置A1C1上。 在板布局上选中区域A1C1。 打开包含有auto series项的unknown对话框。 输入各参数。 点击ok以确认。使得板布局为：4.2.9 相对定量的样品类型相对定量中，是在目标基因之间做比较，这些基因具有不同的表达水平，分别来自经过各自处理的样品中。它们分别与非

49、调控的参考基因（持家基因）相比。然后根据方法计算出其表达水平。所有的样品均作为未知基因进行编辑。4.2.9.1 多plex分析例子在多plex分析中，目标基因和持家基因在一个试管内用两种不同的染料进行检测。加工过的样品： 在板布局中选择B2B4区域 打开unknown对话框 通过target gene（s）面板选择两个基因。 通过在housekeeping gene复选框，在use of target gene(s)面板中明确 持家基因，用组合框选择相关的染料。 点击ok以确认。 将位于B2B4的样品组成一组。未经处理的样品（校准器） 在板布局中选择C2C4区域。 打开unknown对话框。

50、通过target gene(s)对话框选择两个基因 通过在housekeeping gene复选框，在use of target gene(s)面板中明确 持家基因，用组合框选择相关的染料。 在relative quantification/gene expression面板中，选中复选框set sample as calibrator来将样品定义为校准器。 点击ok以确认。 将位于C2C4的样品化为一组。处理过的样品：未经处理的样品：样品被编辑完成后，板布局如下图所示：用作校准器的样品有淡颜色条的标志。4.2.9.2 单plex分析的例子对于单plex分析，目标基因和持家基因在不同的试管内接

51、受检测，使用同样的染料。处理过的样品：a） 在板布局中选择C2C4区域。 打开unknown对话框。 在target gene(s)面板中输入 持家基因的名称。 通过在housekeeping gene复选框，在use of target gene(s)面板中明确持家基因，用组合框选择相关的染料。 点击ok以确认。 将位于C2C4的样品归为一组。b) 在板布局中选中B2B4区域。 打开unknown对话框。 在target gene(s)面板中输入目标基因的名称。 点击ok关闭unknown对话框。 将位于B2B4的样品归为一组。 在该组内选中至少一个位置，然后在此打开unknown对话框。

52、通过组合框well with housekeeping gene(monoplexing)向孔内分配（或赋值），其中 持家基因在此被检测到。选择C2C4的其中一个包含有持家基因的位置。在计算中，结果将合并分组样品的平均值。 点击ok以确认。a) 处理过的样品（目标基因）b) 处理过的样品（持家基因）未经处理的样品a) 在板布局内选择C5C7区域。 打开unknown对话框。 在target gene(s)面板中输入持家基因的名称。 通过在housekeeping gene复选框，在use of target gene(s)面板中明确持家基因，用组合框选择相关的染料。 在relative qua

53、ntification/gene expression面板中，通过复选框set sample as calibrator定义样品为校准器。 点击ok以确认。 将位于C5C7的样品归为一组。b) 在板布局中选择B5B7区域。 打开unknown对话框。 在target gene(s)面板中输入目标基因的名称。 点击ok以关闭unknown对话框。 将位于B5B7的样品归为一组。 在该组内选中至少一个位置，然后再次打开unknown对话框。 通过组合框well with housekeeping gene(monoplexing)向孔内分配（或赋值），其中持家基因在此被检测到。选择C5C7的其中一

54、个包含有持家基因的位置。在计算中，结果将合并分组样品的平均值。 点击ok以确认。样品编辑完成后，板布局如下图所示：4.2.10 熔点分析中的样品类型在熔解曲线分析中，没有特别需要考虑的方面。4.2.11 终点测定中的样品类型在执行终点测定标准时，阴性对照和未知样品需要被查实。更多细节请查阅4.2.6节中的内容。4.2.12 +/-检测项目中的样品类型执行一个+/-检测项目时，除了未知样品以外，还需要编辑阳性和阴性对照。4.2.12 样品的复制与剪切该过程中用到的copy, cut和paste命令既可以通过鼠标右键，也可以通过菜单plate layout来实现。为复制板布局样品，首先选中样品，然后通过copy命令复制样品到剪切板上。随后在板布局中选中一个位置，再使用paste命令将样品类型插入其中。Cut命令可以用来剪切样品，然后在板布局另一位置通过paste命令插入该样品。4.2.15 删除样品 首先选中一个或者多个样品，然后点击图标delete samples来删除样品。4.2.16 几个样品的归组除了在4.2.7节中提到的选项以外，也可以通过将板布局中已存在的样品归为一组的形式建立复制。归为一组的前提是样品类型和其他数据之间是对应的。组内的样品名称不一定要相同。 如果板布局内的几个样品被加亮后，再选中group图标，那么这些样品就归为了