WS 195-2001 军团病诊断标准及处理原则

WS1952001前言军团病LEGIONNAIRESDISEASE是由军团菌属LEGIONELLA、主要是嗜肺军团菌LEGIONELLAPNEUMOPHIA引起的一种细菌性呼吸道传染病。本病在全球普遍存在。我国已有小规模爆发及散发病例。由于军团菌肺炎与其他肺炎不易区别，且老年人容易受到侵犯，一旦患病，病情相当严重。如治疗不当，其病死率可高达1520。为了对军团病患者提供可靠的诊断，进行合适的治疗，结合我国军团病防治工作现状特制定本标准。本标准附录A中A2,A3,A4,附录13中133,134,135,136及附录C的诊断方法为参考诊断方法。本标准由卫生部疾病控制司提出。本标准负责起草单位中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所参加起草单位，协和医院本标准主要起草人万超群、朱元环陆慰IT本标准由卫生部委托传染病防治监督管理办公室负责解释。中华人民共和国卫生行业标准军团病诊断标准及处理原则WS1952001DIAGNOSTICCRITERIAANDPRINCIPLESOFMANAGEMENTOFLEGIONNAIRESDISEASE参照中华人民共和国传染病防治法力及中华人民共和国传染病防治法实施办法制定本标准，范围本标准规定了军团病的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级、各类型医疗保健、卫生防疫机构和人员对军团病病例的诊断和处理2诊断原则21应根据流行病学资料及临床表现和常规实验室检验结果进行综合分析。22确诊需依据病人双份血清军团菌抗体恢复期较急性期增高4倍或以上或军团菌培养阳性。3诊断标准31流行病学史全年均可发病，多数发生在夏秋季节。中老年病例较为多见。有慢性肺病病史者、免疫功能低下者、器官移植者、建筑工地施工人员、近两周内的旅行者以及吸烟者较易感。如发现两例或以上的成组病例，应当进行血清流行病学调查。同时对可疑军团病患者的标本，如痰、血液、胸水、支气管肺泡灌洗液进行军团菌的分离培养，还可从外环境如宾馆、医院、电影院等的空调系统冷却塔水、淋浴水、湖水、井水、池水以及地表面污水中分离军团菌32临床表现临床上可以有两种类型非肺炎型印ONTIACFEVER和肺炎型。321非肺炎型临床表现类似感冒，症状发热、咳嗽、头痛、肌痛和胸痛，但无肺炎。病程310天可自愈。322肺炎型亚急性起病，症状发热、头痛、寒颤、咳嗽或痰中带血，胸痛和肌痛，部分病人有恶心、呕吐、腹泻、相对缓脉，有些患者尤其是儿童，可出现精神神经症状如澹妄、幻觉甚至昏迷等，重症病人可发生急性肾功能衰竭、休克，或因菌血症产生的肺外器官感染。X线胸片显示肺有浸润性阴影，部分有胸腔积液，重症病人有肺脓肿甚至空洞。33常规实验室检查多数血沉加快，血白细胞计数增高，部分有中性白细胞核左移，可能有乳酸脱氢酶、血清谷草转氨酶、胆红素升高或有蛋白尿、低钠血症和低磷血症，血尿并不多见，但镜检时尿中可有红细胞。痰或气管内抽吸物作革兰染色和一般培养。军团菌为革兰阴性杆菌，但初代分离菌革兰染色着色不明显，而且培养的阳性率很低。34特异性实验室检查参见附录A、附录B、附录C341军团菌培养_中华人民共和国卫生部20010720批准20020101实施WS1952001以痰、支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗液或胸水为标本，在含N2一乙酞氨基2氨基乙烷磺酸AES的酵母浸膏培养基BCYE中培养军团菌。342细菌抗原检测采用直接荧光抗体法DFA343血清特异性抗体检测采用间接荧光抗体法IFA,试管凝集试验TA等方法检测军团菌特异性抗体。起病时及118周后两次血清军团菌抗体滴度呈4倍或以上增长，单次抗体大于12561FA，或凝集抗体从140呈D倍或以上增长或一次凝集滴度为1320TA者，可确定有军团菌感染35病例分类351临床诊断满足31,32,33加342352确诊病例满足31,32,33加341或3424处理原则参见附录D41、早期发现病人早期治疗对可疑病人应及时进行特异性实验室检查以明确诊断。确诊者可选用红阿奇霉素等或和利福平一并使用，复方新诺明、四环素、环丙沙星、强力霉素对部分病人有效应尽量避免使用糖类皮质激素。42早期发现并发症如急性肾功能衰竭、休克等应及时积极抢救。43如发现成组病例应向防疫部门报告，通过流行病学调查证实后，采取合适的防治措施，对被军团菌污染的水源，如建筑物中的空调系统冷却塔水、冷热水管道系统水进行细菌学检测，必要时进行消毒处理。对可疑者及易感人群选用红霉素、阿奇霉素等治疗。WS1952001附录A标准的附录军团病病原学诊断方法A1直接荧光抗体染色检查法本法操作简便，能快速发现各种被检病理标本中是否存在军团菌。但当标本中军团菌数量较少或病原菌为荧光抗血清未包括的新种型时，结果常为阴性，故阴性结果不能排除军团病。AL1荧光抗体制备A111用1甲醛盐水自固体培养基上洗下军团菌菌苔,4C过夜杀菌,PH72操作PBS洗2次配制成4X109/ML菌细胞的菌液A112免疫前自家兔取血，用作对照血清，采取皮内注射法或静脉注射法免疫家兔。如凝集反应效价达到1，5120以上可以全放血，并分离血清。AL13免疫前兔血清与抗军团菌血清用5033饱和度硫酸钱提取R球蛋白调整蛋白浓度为20MG/ML。按常法用异硫氰酸荧光素FIT标记。A12标本制备AL21肺组织新鲜组织可制成印片或研磨成1OY,悬液后涂膜于空气中干燥后加热固定。再在涂膜上滴加10中性甲醛固定10MIN。吸弃甲醛后用蒸馏水轻轻漂洗，干燥后镜检。如为甲醛固定组织，可用刀片切成组织块，造成新的组织面，用刀片呈直角在组织上刮取细微的组织颗粒糊，于载玻片L涂膜，干燥后加热固定。AL22其他标本痰、支气管灌洗液或抽出物、胸水应注意抗凝可选取粘性部分胸水等也可离心取沉淀物涂膜，干燥后加热固定。10中性甲醛固定10MIN,蒸馏水漂洗，干燥后染色镜检。可疑培养物用接种环挑取可疑菌落混悬于1甲醛等渗盐水中，涂膜，干燥，加热固定。A13染色方法A131荧光抗体工作溶液配制将标准军团菌株用PBS制成悬液后涂片，使每高倍视野菌数50060。条，用不同稀释度的荧光抗体染色。凡出现3十4荧光强度的最高稀释度为1个效价单位3菌细胞发明亮的黄绿色荧光4菌细胞发耀眼的黄绿色荧光。常规工作中用2个效价单位作为L作溶液。AL32操作每份标本在同一张载片上作两个涂膜。一个用免疫前兔R一球蛋白荧光素标记物染色作阴性对照另一用荧光抗体染色。置37C湿盒中温育30MIN后用PBS洗去多余的荧光血清洗时载片加有荧光抗体的一侧向下，并用PBS浸洗2次每次5MIN,燕馏水冲洗1次，干燥，涂膜滴加PH90缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。A14结果的解释痰胸水、气管抽吸物或灌洗液等标本，每张涂膜上只要发现5条以上染色鲜明、形态典型的军团菌，即可报告阳性。其他临床标本，每张涂片发现有25条强烈发荧光的细菌，报告为阳性,124条为可疑，。条为阴性。A2军团菌多里报合醉链反应MPCR和产物检测参考A21寡核昔酸引物的合成由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所军团病课题组设计的一对引物，用以扩增嗜肺军团菌，可产生2066的产物MIL基因片段。另一对引物为扩增16SRRNA用。不仅可检测嗜肺军团菌种，而且可以检测某些非嗜肺军团菌种。WS1952001A22扩增程序在容积为05ML的EPPENDORF离心管中加人100PI10XPCR缓冲液1/10体积DNTPS200PMOL/LTAQ酶2UNITS引物1,2CNIP02PMOL/I引物3,416SRRNA005PMOL/I模板DNA可用至2PG，取决于靶序列含量加灭菌三蒸水至最终体积100川，最后加人40风的灭菌石蜡油。试验分别设立阳性对照和阴性对照各一份。A23循环参数94C61C72C循环次数首次循环2MIN45S45S1正式循环45，45S45S30末次循环45S45S2MINI取扩增产物10讨加人2皿6X澳酚蓝电泳指示缓冲液，在含有05PG/ML的嗅化乙锭的琼脂糖凝胶，于。5XTBE或TAE缓冲液中进行电泳，电压5V/CM，电泳30MIN后，在紫外灯下观察结果、A24结果凝胶中出现两条特异性DNA带分别为206个碱基对206BY及386个碱基对386BP或一条特异性DNA带386BY则PCR为阳性，如重复试验后未出现特异性DNA带，则PCR结果为阴性。如待检材料痰、支气管灌洗液、血液等PCR阳性，则提示标本中有特异性军团菌DNA片段，出现两条特异性DNA带为嗜肺军团菌感染，一条特异性DNA带为非嗜肺军团菌感染。A3协同凝集试验参考此法原理是利用金黄色葡萄球菌A蛋白SPA可与某些动物IGG的FE段结合的特性，将军团菌的特异性抗体IGG组分结合于含SPA的金黄色葡萄球菌上，再用此致敏SPA菌液与标本含军团菌可溶性抗原的检样或可疑军团菌培养物进行协同凝集试验。此法重复性及稳定性较差，但操作方便，可供参考A31试剂A311SPA菌稳定液AL111将含SPA的金黄色葡萄球菌COWAN1株或NOL800株接种于固体培养基或液体培养基。固体培养基蛋白陈或际陈MOG,葡萄糖1G,氯化钠3G,磷酸氢二钠NA,HPO,12H,02G，琼脂25G,牛肉汤1000ML用氢氧化钠溶液调PH至74,121C20MIN高压灭菌，倾注平皿。液体培养基T培养墓胰蛋白陈TRYPTICASE5G，半胧氨酸100MG,酵母浸膏375ML,葡萄糖5G,抓化钠375G,蒸馏水500ML，调PH至74,115C30MIN灭菌。葡萄球菌COWAN1株以接种液体培养基为好，在固体培养幕上生长者易发生菌体自凝。A311237C培养24H后用001MOL/I,PH74PBS自固体培养基上洗下菌苔,3000R/MIN离心20MIN如在液体培养基中培养，则直接离心。弃取上清，沉淀用PBS洗2次，再用含05甲醛的PBS配成10V/V悬液于室温放置3H或过夜。然后置80C水浴15MIN时时摇动，取出后迅速冷却，用PBS洗3次，再用含10G/LNAN的PBS配成10V/V悬液。4C保存可用半年。用前离心，弃L清，用PBS洗1次A312致敏SPA菌液抗体葡萄球菌复合物取上述10SPA菌稳定液1ML，加军团菌种或F1特异性抗血清01ML,混匀于室温反应30MIN，时时摇动。反应完毕，用PBS洗2次。沉淀恳于含WS195200110G八NAN、的PBS10ML中，制成10/N悬液或200。分装，4C保存，可用半年左右A32试验方法与结果判定试验在载玻片上进行。取致敏SPA菌液1滴，加标本如为尿标本可沸水浴5MIN,离心去沉淀。必要时可用分子量6000的聚乙二醇浓缩1050倍。如为待鉴定的细菌培养物，可制成10亿菌/ML，然后100C水浴15MIN,1滴尿或内径5MM接种环一满环菌液。充分摇匀，在8W日光灯上方观察结果。判断标准为理菌体凝成大块，液体透明3菌体凝成大颗粒，液体透明。2十菌体凝成较大颗粒，液体较透明。1菌体凝成小颗粒，液体混浊。一无颗粒形成液体全混。或2MIN后才有细小颗粒。一般以2十为阳性。将菌液100加热15MIN，可以避免喷肺军团菌，博杰曼军团菌和米克戴德军团菌等鞭毛I的非特异性类属抗原所引起的交叉协同凝集反应AQ乳胶凝集试验参考将D1售聚苯乙烯胶乳POLYSTYRENELATEX颗粒08MM用蒸馏水配制成贮存液，使其在1100稀释时于650RUN吸光度达。355。取1份胶乳贮存液加抗军团菌抗体IGG100PG/ML和用01MOL/1PH80甘氨酸缓冲液配制的牛血清白蛋白200TAG/ML混合液1份，充分摇匀数分钟，37C水浴2H，再加人牛血清白蛋白2份，37水浴30MIN。于4C18000G离心10MIN。沉淀用1牛血清白蛋T3洗1次，再悬人1份牛血清白蛋白中，加叠氮钠NAN至004,4C保存。对照胶乳试剂用来免疫家兔IGG同法制备。待检尿标本沸水浴5MIN以减少非特异凝集，离心除去沉淀，涂于黑玻璃上的圆环内，滴致敏乳胶和尿标本各1滴充分混匀，在防止干燥的情况下于180次/MIN震荡器上摇动20MIN。肉眼观察，以妻为阳性。用此法检测尿中嗜肺军团菌血清1型可溶性抗原。A5细菌分离培养A51军团菌培养基的制备1000MIA511称10GN一二乙酞胺基一二胺基乙烷磺酸ACES倒人锥形瓶，加蒸馏水950MLA51215NIL10COOL/L氢氧化钾溶液调PH至7。A513称10G酵母浸青加人锥形瓶，混合后分装到两个锥形瓶中，各500MLA514每个锥形瓶再加人LOG琼脂粉和1G活性炭,1213C20MIN同时高压一小瓶蒸馏水和两个滤器，两支注射器A515分别称04G焦磷酸铁和。6G1,一半胧氨酸盐酸盐，置于两个平皿中A516待培养基温度降至约60C时，将灭菌蒸馏水溶解的焦磷酸铁和半胧氨酸，通过滤膜022PIN过滤除菌，等量加到两个锥形瓶中A5飞了倒人平皿，梅个约20ML，覆盖整个平皿底部。A52痰液直接培养法A521试剂配制A5211酸中和试剂的配制A。2MOL/1氯化钾溶液149G/LB02MOL/I_盐酸172ML/L18份A和1份B混合PH20A5212碱中和试剂的配制WS1952001G01MOLL氢氧化钾溶液646G/L取107ML893ML蒸馏水PHL322步骤取少量病人痰液至试管中加入1ML,碱中和剂，混匀，加1ML酸中和剂，混匀，静置10MIN，静置10MIN。离心沉淀，吸取少量沉淀物到BCYE培养基平匕J亡J仄口AAA皿匕划线接种。35C烛缸中孵育。观察7天，如发现可疑菌苔，进一步进行鉴定。附录B标准的附录军团病的血清学诊断方法间接荧光抗体染色法B1B11试验用液11稀释液稀释菌液、血清及荧光抗体用0OFMOL/LPBSPH76氯化钠80G磷酸氢二钠299磷酸二氢钾029蒸馏水1000ML2实验步骤21抗原片抗原片用酒精棉球擦拭后，用稀释液将菌液稀释10倍，使之成为10亿/ML，然后滴人川BIBI抗原片孔中，待自然干燥后，用丙酮固定30MINB122取反应板递倍稀释待检血清，181，512，分别滴加到抗原片中，留两孔作为对照，置湿盒中，37孵育1H8123洗涤3次，每次3MIN，不断摇动8124用稀释液按I8稀释荧光抗体加人每孔，置湿盒中，37C1HB125洗涤，同上。B126结果判断4十菌细胞发出耀眼的黄绿色荧光3菌细胞发出明亮的黄绿色荧光荧光清晰，但较3弱荧光较弱，刚可辨认一菌细胞不发荧光。B2试管凝集试验B2门将洁净无菌处理的试管整齐摆放于试管架上，每一血清型5管，另设阴性对照抗原对照B22在第一管中加人经高压灭菌的生理盐水09ML，其余各加05ML，阳性对照管加人05ML适当稀释的兔抗军团菌血清1S23在第一管中加人。1ML，待检血清，倍比稀释。B24将浓缩的凝集抗原制备方法同BI用经高压灭菌的生理盐水稀释到终浓度为10亿/ML，各管分别加人稀释后凝集抗原05ML其最终凝集反应滴度为11201320,3537C反应过夜，次口观察结果。3互1WS1952001BZ5结果判定4卜清完全透明，菌体于管底呈伞状沉淀，摇荡时沉淀物产生絮片及颗粒100写凝集3上清儿乎完全透明，有同样的沉淀，当摇荡时产生絮片及颗粒75凝集2卜清稍为透明，有同样的沉淀当摇荡时产生絮片及颗粒50凝集1液休有勉强的透明度，底部有不大的扇状沉淀一液体均匀混浊，底部无扇状沉淀。B26标准凝集度为“”的血清最大稀释度为血清效价。B27单份血清抗体效价1次大于等于1320或双份血清抗体效价从140呈4倍或以上增长者可诊断为该血清型军团菌抗体阳性。B3B31微T凝集试验参考实验用液稀释液0067MOL/1,PBSPH64磷酸氢二钠NA,HPO,12H,0621G磷酸二氢钠NAH2P02H,O769G氯化钠850G蒸馏水1000ML实验方法V形孔板每孔加25川稀释液第一孔加人25川一待检血清，倍比稀释，最后一孔留作阴性对照抗原对照S稀释凝集抗原5倍稀释，使菌液浓度成为2。亿/ML，每孔25川置湿盒中37、1H，再置4C冰箱4H置日光灯下观察结果，以I32为阳性或双份血清有4倍增高者有诊断意义。B32B321B322B324B325B4ISA法B41缓冲液B411包被液碳酸盐缓冲液PFI96碳酸钠无水L50G碳酸氢钠293G蒸馏水1000MLB412稀释液磷酸盐缓冲液PH74氯化钠80G磷酸氢二钠NA2HPO,12H,029G磷酸二氢钾。29蒸馏水1000MLB4门3洗涤液上液加人。5ML，吐温20B414底物缓冲液PH50甲液C,H,O无水1929八乙液NA,HPO,12H,0716G/L甲液243ML，乙液257ML，蒸馏水50ML，混合即得PH50磷酸拘椽酸缓冲液100NILB415邻苯二胺底物配制磷酸构徐酸缓冲液PH5100ML,邻苯二胺40MGWS195200130过氧化氢溶液。15MLB42操作方法B421包被用包被液1100倍稀释可溶性抗原按常规方法制备，酶标板各孔加人稀释过的包被液100PL,4C冰箱过夜B422洗涤3次。每次3MINB423封闭用含1小牛血清自蛋白稀释或白明胶稀释液，37C，30MINB424洗涤同上，加待检血清100川/孔，血清从1，10倍比稀释至12560，最后一孔为阴性对照，每批实验中，撼型设一排阳性血清对照和正常兔血清对照。B425洗涤，加酶结合物100PT/孔，37C,1H,B426洗涤，加邻苯二胺底物液100R,L/孔，37C,15MIN，每孔加人50PL,2COOL/I，硫酸溶液终止反应B427结果判定3二495NM测OD值质控标准阴性对照A成O2阳性血清在1，320稀释度AO3正常兔血清在4X10道尔顿。用免疫酶标记技术证实存在于菌细胞表面。间接血凝试验所用的可溶性抗原，系用PBS浸取的粗制抗原。制备方法如下B61，用灭菌的。01MOL/L,PH72PBS自BCYE琼脂培养基上洗下菌苔，于ARNOLD灭菌器内101C处理1H或沸水浴1H,离心弃上清B612用灭菌PBS洗沉积的菌细胞2次B613按每。1ML,沉淀菌细胞加灭菌PBS2ML，制成细菌悬液。于4C置10天，经常摇动B6143500R/MIN离心20MIN，上清即为可溶性抗原。B62致敏绵羊红细胞取20甲醛、丙酮醛醛化红细胞悬液01ML绵羊红细胞双醛化法，见“注”,1500R/MIN离心5MIN弃上清，加人用。2MOL八,PH40乙酸一乙酸钠缓冲液稀释的军团菌可溶性抗原1ML稀释度通过方阵滴定法预试选定，混匀。37C水浴1H致敏。用PBS洗3次后，以含1G/L明胶、04G/T牛血清白蛋白、05V/V羊细胞膜的PH72011MOT/LPB稀释液配成0700悬液。B63操作与结果解释于V型46孔微量血凝反应板上按常法进行，待检血清用稀释液自1，2起作连续双倍稀释至14096。试管排各孔补加稀释液1滴，阻断试验排各孔加最适稀释度抗原1滴，然后各孔均加致敏红细胞1滴。各孔总量为0075ML，混匀MIN,置37C湿盒12H后观察结果。以500X2凝集为终点。阻断试验排出现血凝抑制应2孔。每批试验应以相应的兔杭军团菌抗血清作阳性对照，其血凝效价变化不应2孔。如双份血清抗体效价明显增高者，可考虑军团菌感染。注双醛化绵羊红细胞SRBC的制备1将SRBC用1020倍容积011MOL/LPH72PB洗5次，再用此PB配成8悬液2缓慢加人等容积丙润醛、甲醛混合液丙酮醛15ML甲醛8ML,O11MOL/L,PH72PB60ML，用100G/L氢氧化钠溶液调PH至72，再补加PB至100ML，室温缓慢搅拌17H,1500R/MIN离心20MIN弃上清沉积细胞用PB洗3次并配成20到悬液，加叠抓钠NEN,至1创L,4C保存备用附录C标准的附录军团病分子生物学诊断方法参考用地高辛标记的特异性军团菌DN八探针进行核酸杂交检查，全过程包括探针标记、靶DNA的制WS1952001备、膜结合、杂交和显色5个步骤。C1地高辛DIG标记DNA探针CL1特异性DNA片段的获得PCR或全染色体酶切取特定分子量片段。CL2DNA片段的纯化和回收低溶点琼脂糖凝胶纯化法或透析袋纯化法，经酚/三抓甲烷抽提，乙醇沉淀C13DNA片段的DIG标记随机引物法将完全变性的DNA片段加进微型离心管内置于冰浴中，分别加人2KI六核昔酸混合物2川DNTP标记混合物再加人适量灭菌三蒸水调溶液体积为”川，短暂离心，最后加入1PLKLENOW酶，混匀，37C孵育IH以上，也可过夜。用EDTA终止反应。C14探针的标记效果检测DOTBLOT反向杂交法将已制备好的探针100C沸水浴变性5MIN，立即置于冰水浴中5MIN以上。取少量1川一左右点于硝酸纤维素膜上，SOC固定后，直接进人结果检测过程。C2靶DNA的制备C21细菌培养军团菌BCYE培基,35C烛缸培养48HC22DNA提取SDS裂解，酚/三抓甲烷抽提法。C3DNA结合千硝酸纤维索膜上C31SOUTHERNBLOT电泳结束后，琼脂糖凝胶变性60MIN变性液06MOL/L氯化钠溶液02MOLA氢氧化钠溶液，蒸馏水漂洗1MIN中和60MIN中和液015MOL/LTRISHCIHH76,15MOT/I氛化钠溶液，弃中和液转膜。C32DOTBLOT将DNA样品在沸水浴中变性1OMIN，迅速放于冰水中，用微量加样器将样品加到硝酸纤维膜上，晾干后80C固定2H。以三燕水或已知无特异DNA片段的样本作为阴性对照。C4探针与靶DNA杂交D41预杂交将转移好的硝酸纤维素膜装人大小相仿的塑料袋内，加人预杂交液，封口，68C预杂交1H以上，晃动。C42杂交去预杂交液加人杂交液含DIG11DUTP标记探针，其余成分同预杂交液,70保温6H以上杂交条件取决于探针和靶DNA洗去未杂交的探针2XSSC,I0G/LSDS100ML,5MINX2,室温。IXSSC,10G/LSDS100ML,70C,15MINX2洗膜时置摇床上摇动。C5杂交结果的检测C51地高辛抗体结合先将杂交膜在缓冲液I中室温洗1MIN，换缓冲液1100ML室温洗膜30MIN，倾去液体，加人20ML抗体液含抗体地高辛150U/ML，缓冲液I浸泡30MIN，室温。C52显色用缓冲液1100ML洗膜,L5MINX2，去除未结合的抗体换缓冲液R20ML，平衡膜2MIN将膜装人塑料袋内，加人10ML显色液，封膜，避光数分钟至24H，及时观察到显色满意时，用50ML缓冲液N洗膜终止反应。C6结果判定当硝酸纤维素膜上出现有蓝色条带SOUTHERNBLOT，大小与琼脂糖凝胶中DNA条带相仿或蓝色圆点DOTBLOT，即为检测结果阳性，同时，阴性对照应无染色。部分试剂的配制349WS195200120XSSC,氯化钠NA,C,H50,2H2010MOL/L氢氧化钠调PH值到750只DEN