毕业论文-银杏内生真菌分离培养及生物活性测定

化学工程与食品科学学院毕业论文（设计）题目银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定专业生物科学班级0911班学生姓名岳继萍学号2009124121指导老师阎华二一三年五月摘要内生真菌是一类生长于活体植物组织中的特殊的真菌，研究相对较少，生长于独特环境中，具有药用价值树龄长或有地域特色的植物中一般都能分离出新的内生菌，而新种或罕见菌种又能为寻找新型生物活性物质提供前景银杏是我国特色珍稀植物，具有。活化石。之美称。银杏在生长期间很少感染病虫害，寿命极长，因此具有很好的挖掘新型内生真菌的潜力，本研究采集湖北省襄阳市湖北文理学院内银杏枝条和树叶，采用组织分离法分离其中的内生真菌，筛选具有杭菌性和抗氧化活性的菌株并通过形态特征进行初步鉴定；对其中三株株杭菌活性显著且稳定的不产孢菌进行形态学研究和分子解析，对培养条件和培养基组成进行优化，进而分离其发酵产物中的抗菌活性物质并进行结构鉴定，为进一步工业化生产应用提供工作基础和依据。银杏，又名白果，是我国特有的世界珍稀名贵树种，是冰川运动遗留的孑遗植物，被称为活化石，具有极高的研究开发价值。银杏各组织含有抑菌物质，据报道，银杏根、茎、叶、果肉外种皮及果仁的提取物对水稻纹枯病菌、黄瓜炭疽病菌和番茄青枯病菌等有明显的抑制生长作用68。本研究以银杏为材料，从中分离筛选具有抑菌作用的内生真菌，旨为新型微生物源农药的研制和开发提供优良的出发菌株。关键词内生真菌银杏抗菌性分离ABSTRACTENDOPHYTICFUNGIISAKINDOFSPECIALFUNGUSGROWTHINLIVINGPLANTTISSUE,WHITCHRESEARCHISRELATIVELYSMALL,ITGREWUPINSPECIALENVIRONMENT,WITHMEDICINALVALUEANDOLDLONGORHAVEREGIONALCHARACTERISTICSOFPLANTSINGENERALCANBENEWENDOGENOUSBACTERIAWASISOLATED,WHILENEWSPECIESANDRARESPECIESCANPROVIDEPROSPECTSFORSEARCHFORNEWBIOACTIVESUBSTANCESGINKGOISCHARACTERISTICSOFRAREPLANTSINOURCOUNTRY,HAS“LIVINGFOSSILS”GOODNAMEGINKGORARELYINFECTIONDISEASESANDPESTSDURINGGROWTH,ITSLIFEISVERYLONG,SOITISGOODTODIGUPTHEPOTENTIALNEWTYPEOFENDOPHYTICFUNGI,THISSTUDYCOLLECTEDHUBEIPROVINCEOFHUBEILIBERALARTSCOLLEGEINGINKGOBILOBALEAVESANDBRANCHESOFXIANGYANGCITY,USINGCHROMATOGRAPHYSEPARATIONOFENDOPHYTICFUNGI,BACTERIASCREENINGWITHANTIMICROBIALPROPERTIESANDANTIOXIDANTACTIVITYOFSTRAINSANDPRELIMINARYIDENTIFICATIONOFMORPHOLOGICALCHARACTERISTICSSIGNIFICANTACTIVITYOFTHREEBACTERIAANTIMICROBIALPROPERTIESANDSTABLEDOESNOTPRODUCEROBE,STUDIEDTHEMORPHOLOGICALANDMOLECULARANALYSIS,OPTIMIZETHECULTURECONDITIONSANDMEDIUMCOMPOSITION,ANTIBACTERIALACTIVITYOFTHEFERMENTATIONSUBSTANCESINTOMISEPARATIONANDSTRUCTURALIDENTIFICATION,FORFURTHERINDUSTRIALIZEDPRODUCTIONAPPLICATIONWORKPROVIDEDHIANDBASISGINKGO,ALSOKNOWNASGINKGO,ISOURCOUNTRYUNIQUERAREANDPRECIOUSTREESPECIES,ANDTHEMOVEMENTOFGLACIERISTHELEGACYOFPRECIOUSPLANTS,KNOWNASLIVINGFOSSILS,THERESEARCHANDDEVELOPMENTHASAVERYHIGHVALUEEACHGROUPOFGINKGOCONTAINSANTIBACTERIALSUBSTANCES,ACCORDINGTOREPORTS,ROOT,STEMANDLEAF,GINKGOPULPTESTAANDTHENUTEXTRACTSOFRICESHEATHBLIGHTFUNGUS,ACUCUMBERANTHRAXANDSOLANACEARUM,HAVEOBVIOUSEFFECTONINHIBITIONOFGROWTHTHISSTUDYMATERIALFORGINKGO,SEPARATINGFILTERHASTHEBACTERIOSTASISOFENDOPHYTICFUNGI,PURPORTFORTHEDEVELOPMENTANDTHEDEVELOPMENTOFNEWMICROBIALPESTICIDESPROVIDEEXCELLENTSTRAINSKEYWORDSENDOPHYTICFUNGI；GINKGO；ANTIMICROBIALPROPERTIES；SEPARATION目录11前言211内生真菌3111植物内生真菌简介3112内生真菌多样性3113内生真菌的生物学作用412植物中银杏内生真菌的研究概况513本研究主要内容和意义52实验621实验材料6211银杏样品来源和采集方法6212抗菌实验指示菌7213培养基187214主要仪器设备7215主要试剂822实验方法9221内生真菌分离方法9222内生真菌的液体培养及抗菌试验9223内生真菌XY28菌株DNA的提取923结果和分析10231银杏内生真菌的分离方法比较10232抗菌活性菌株的筛选123讨论154小结17致谢17参考文献181前言植物内生真菌是一类生长于健康活体植物组织中的特殊的真菌，它们是植物组织内的正常菌群，主要存在于表面细胞层下的组织中，而且宿主组织暂时没有症状。尽管近二十多年来人们对内生真菌的研究越来越关注，但相对于其它真菌类群来说，对内生真菌的研究还比较肤浅。目前世界上许多人都在对内生真菌进行分离并研究其产物。内生真菌与宿主长期共存，因此可能存在着能与植物宿主的遗传信息相互交换的遗传系统，能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分。与植物表面菌或土壤微生物相比，内生菌与相应宿主有着更近的生物联系，因此可被利用生产大量的生物活性物质。最近有研究表明从内生真菌中分离到的生物活性物质，有51是以往不为人知的，而相比之下，土壤菌群只有38。银杏是我国的一种珍稀植物，是现存种子植物中最古老的“活化石”，含有丰富的营养保健因子如银杏内醋和银杏黄酮，同时具有很强的抗病毒、抗菌消炎、抗过敏等作用，在生长过程中几乎不感染病虫害、寿命极长，因此从银杏中分离到具有抗菌活性的内生真菌的可能性非常大。本研究从银杏枝条和树叶中分离内生真菌，从中筛选具有抗菌活性的菌株，对其中一种活性稳定的非产孢菌株进行形态学研究对其发酵条件和培养基组成进行优化，进而研究了发酵产物中具有抗菌活性的化学组成，鉴定了其中一种物质的结构，另外，提取了该菌的DNA物质，为进一步研制开发优良的功能性食品添加剂打下了基础。11内生真菌111植物内生真菌简介植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物至少是暂时不表现出外在病症，可通过组织学方法从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生1。植物内生菌是植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物，主要存在于表面细胞层下的组织中，而且宿主组织暂时没有症状2。内生菌包括内生细菌和内生真菌，其中内生真菌的分离频率最高，自1898年VOGL从黑麦草LOLIUMTEMULENTUML种子内分离出第一株内生真菌至今，关于内生真菌的研究已有一百多年的历史，但由于内生菌生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，其存在和作用长期以来一直为人们所忽视。尽管近二十多年来人们对内生真菌的研究越来越关注，但相对于其它真菌类群来说，对内生真菌的研究还比较肤浅。112内生真菌多样性地球上有上百万种植物，几乎所有的植物中都有内生菌。全世界现已发现69000多种真菌，而且每年还以1000余种的新种递增，保守估计全世界真菌总数可达150万余种3。从目前已经研究过的植物来看，还没有发现未分离到内生真菌的物种，因此可以推断内生真菌在植物体内是普遍存在的4。目前发现的内生真菌大部分是子囊菌类ASCOMYCETES，包括盘菌纲DISCOMYCETES核菌纲PYRENOMYCETES、和腔菌纲LECULOASCOMYCETES，少数为结合菌类和担子菌类BASIDIOMYCETES。常见的属有曲霉属CASPERGILLUS、毛霉属MWCOTT、刺盘孢属COLLETOTRICHUM、拟莲点霉属PHOMOPSIS、叶点霉属PHYLLOSTICTA、嫌孢霉属CFUSARIUM等5。植物内生菌是一个十分丰富的微生物类群，其内生菌种类和分布因植物种类及环境的不同而异。内生菌系统地分布于植物体的各部分组织、器官及细胞间隙中，其中叶、叶鞘和种子内的菌丝含量最多6。植物的种类本身、所取样本的多少和样本地周围环境因子的不同，都会影响分离到的内生菌的数量。同一植物的不同组织其内生菌的种类不相同，不同季节同一植物内生菌的种类和数量也不相同7。113内生真菌的生物学作用内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了互惠共生关系，一方面内生真菌可从宿主中吸收营养供自己生长需要，另一方面内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。而且，内生真菌分布于植物组织内，可获得足够的碳源、氮源，受到植物组织的良好保护，因而比暴露于恶劣环境的附生菌和腐生菌具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用。研究表明，感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具生存竞争力。在内生菌一植物宿主一食草动物生态系统中，植物内生菌扮演着前所未知的重要生态学作用。发挥这些作用的物质基础是内生菌产生的丰富多样的次生代谢产物，它们具有多种生物活性，在农业和或医药业中具有重要的应用潜力。（1）增强宿主的生长许多内生菌可产生IAA、叫噪乙睛以及细胞激动素等植物生长激素促进宿主生长，LU等从黄花篙中分离到的一株内生真菌在发酵液中也能积累IAA8，因此感染内生真菌的植物一般比未感染内生真菌的植物生长快。另一方面，内生菌可增进宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收。LYONS等发现在低水平氮源的土壤中，内生真菌可增加宿主对氮元素的吸收，在侵染内生真菌的高羊茅的叶子中，氮元素的含量明显高于没有感染内生真菌的高羊茅9。（2）增强宿主对环境胁迫的抵抗能力CLAY等发现侵染内生真菌的草遭受真菌病害影响的程度远低于没有感染内生真菌的10，这是因为有的内生真菌在宿主内和纯培养中产生有毒物质，如麦角生物碱等，这些内生真菌的代谢产物可对植物致病菌、线虫、昆虫及哺乳动物有抗性。另外，内生真菌可增强宿主抗干旱的能力。3产生重要药理活性物质研究表明，内生真菌可产生丰富多样的次生代谢产物，有的物质与宿主来源的物质类似，如抗菌素1112、植物生长调节剂13、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等。植物来源的活性物质含量一般很低，而且目前世界上的植物资源也日益减少，因此从植物中分离这些物质的成本很高，如紫杉醇每克高达6000美元14。若能利用植物内生真菌发酵产生活性物质，则成本、价格必然下降，对保护环境亦有重大贡献。12植物中银杏内生真菌的研究概况银杏GINKGOBILOBAL是我国特有的多用途树种，起源于2亿3千万年前的石炭纪，是最古老的中生代孑遗植物之一，基本保持了15亿年前的生态特征。因而成为一科一属一种的特殊植物。银杏曾广泛分布于北半球，到了新生代的第三纪末和第四纪初，北半球进入冰川期，世界上大部分地区的银杏完全绝种，惟独我国少数地区的银杏幸免于难，成为现存种子植物中最古老的。活化石。银杏含有丰富的营养保健因子如银杏内酷和银杏黄酮，同时具有很强的抗病毒、抗菌消炎、抗过敏等作用，许多植物生态学家和生理学家对银杏进行考察研究，认为其在逆境中几乎不感染任何病虫害、寿命极长的奥秘关键在于银杏体内、叶中细胞组织中含有一种自卫免疫抗菌的特殊化学物质，即杀菌素，如A一乙烯醛和多种有机酸等。目前通过利用银杏内生真菌的方法来获得代谢产物的研究还不多。蒋继宏等分离出一株产香银杏内生真菌彻ARIUMSP，采用GC舰S对挥发油进行分析，分离出24种组分，鉴定出15种成分，并发现该挥发油具有抗菌活性。申屠旭萍等15从银杏茎中分离到一株内生真菌，在离体条件下发酵液对番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜立枯病菌均有较强的抑制作用，对不同病原菌的抑制率分别为667、483、646、365、571、230，抗菌活性成分在80E以下趋于稳定，PH为7一8时抑菌效果最强，并研究了不同碳源、氮源、无机离子对内生真菌生物学特性和生长的影响，结果发现玉米粉、黄豆饼粉比较适合其生长和抗菌代谢产物的合成，NA对抗菌代谢产物的合成有较明显的促进作用16。申屠旭萍和俞晓平从银杏的根、茎、叶中分离到/株内生真菌，发现内生真菌数量与银杏树龄有关，树龄越高，其含有的内生真菌数量越多，抗菌试验测定结果表明其中29株银杏内生真菌代谢产物对农作物病原真菌具有一定的抑制作用。13本研究主要内容和意义随着人们对食品安全的要求日益强烈，对天然抗氧化和抗菌剂的研究也日益增多。食品的微生物腐败是一个全世界广泛关注的问题，为了延长食品原料及产品的货架期，必须严格控制其中微生物的生长。但近年来由于抗生素和食品保藏剂的广泛使用，出现了越来越多的耐药性菌株，因此有必要寻找各种来源的新型抗菌剂。微生物领域就是一个极具吸引力的天然活性物质来源。除此之外，脂质氧化也是一个易引起食品败坏的因素，并且与各种人类疾病息息相关，如炎症、衰老和癌症。为了解决这一问题，合成的抗氧化剂在工业中得到了广泛的应用。但营养学和毒理学的研究结果表明这些合成的抗氧化剂具有毒副作用，如常用的二丁基轻基甲苯BHT、对丁基轻基茵香醚BHA对生物体有致癌作用，因而引起了社会的关注17。银杏内生真菌分离鉴定及其抗菌抗氧化作用研究相对于化学添加剂来说，植物、微生物等产生的天然生物活性物质具有安全、高效、低毒、不在人畜体内积累等特点，为新型添加剂的应用开拓了美好的前景。在目前普遍采用的植物源物质方面，由于没有统一的规划，滥采乱采、重复试验等现象时有发生。同时，植物资源本身比较稀少，生长速度相对缓慢，再生较难，容易造成生态破坏等问题，制约了植物源产品的开发。而生活在植物体内这一特殊进化环境中的内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的代谢产物，目前对这一领域的开发和研究相对较少，研究发现内生真菌产物中存在多种新型活性物质，如抗病毒、抗菌、抗癌等物质。对这一领域的开发研究在很大程度上避免了传统的开发土壤微生物所遇到的重复筛选的缺点。且真菌易于培养，可以通过育种手段和培养条件优化来大幅度提高其有效成分的产量，以便应用于工业化生产，因而具有广阔的前景。但目前对内生真菌抗氧化和抗菌的研究还很少。本研究从我国珍稀植物银杏出发分离筛选得到多株内生真菌，并对其中一株为YX28的菌株进行系统抗菌活性研究，以期为应用于食品工业或医药提供工作基础。2实验21实验材料211银杏样品来源和采集方法采集湖北省襄阳市湖北文理学院内银杏树上直径为2一3CM左右的健康树枝及新鲜树叶，经70酒精表面擦洗消毒后在火焰上灼烧10S左右使酒精挥发，标号，存放于灭菌小袋中。4保存，待分离。212抗菌实验指示菌大肠杆菌ESCHERICHIACOLIAS12420、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOUSAUREUSAS11865、枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS、酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE、红酵母RHODOTORULASP、青霉PENICILLIUMSP、黑曲霉ASPERGILLUSNIGER。以上供试菌种均由本研究室保存。213培养基18银杏内生真菌分离培养基水琼脂培养基琼脂20G，水L000ML；孟加拉红培养基分别在PDA、CMA、SDA、YEA培养基中加入孟加拉红使其终浓度达40PPM；PDA马铃薯200G，葡萄糖20G，琼脂20G，水1000ML，自然PH，121、20MIN灭菌；液体PD不含琼脂；CMA玉米粉40G，蔗糖10G，琼脂20G，水L000ML，自然PH，121，C、20MIN灭菌；SDA蛋白陈10G，麦芽糖或葡萄糖40G，琼脂15G，水1000ML，调节PH50，121、20MIN灭菌；YEA酵母膏5G，葡萄糖20G，硫酸钱072G，磷酸二氢钱026G，琼脂12G，水1000ML，调节PH55，121、20MIN灭菌；查氏培养基蔗20G，硝酸钠3G，氯化钾05G，硫酸亚铁001G，磷酸氢二钾1G，硫酸镁05G，水1000ML，琼脂15G。121、15MIN灭菌；麦芽培养基麦芽糖1275G，糊精275G，甘油275G，蛋白陈028G，琼脂15G，水1000ML，调节PH至45。12L、15MIN灭菌；细菌培养基肉汤培养基牛肉膏3G，蛋白陈10G，氯化钠5G，琼脂12G，水1000ML，PH70一72；214主要仪器设备全温摇瓶柜太仓实验设备厂生化培养箱上海益恒实验设备有限公司洁净工作台苏净集团安泰公司数显恒温水浴锅国华电器有限公司电泳仪北京六一仪器厂分光光度计HITACHI离心机上海安亭科学仪器厂PCR仪BIORAD真空冷冻干燥仪德国CHRIST公司电热手提式压力蒸汽消毒器上海医用核子仪器厂生物显微镜尼康H60OL扫描式电子显微镜，HNACHI215主要试剂（1）10SDSPH7290ML水中加入10G电泳级十二烷基磺酸钠SDS，加热至68助溶，用NA0H调PH72，加水定容至100ML。（2）氯化苄法抽提液100MMOL/LTRIS一HCI，PH90；40MMNOL/LEDTA，PH80先配制母液500MMOL/LTRISHCIPH90在80ML水中加入6055G三轻甲基氨基甲烷TRIS，溶解后用稀盐酸调PH90，定容至100ML，灭菌备用。500MMOL/LEDTA（PH80在80ML水中加入1861G乙二胺四乙酸二钠NA2EDTA2H2O，用NAOH约2G调PHS0加水定容至100ML，灭菌备用。抽提液配制于60ML水中加入20ML500MMOL/LTRIS一HCIPH90和8ML500MMOL/LEDTAPH80加水定容至100ML。33MOL/LNAACPH5280ML水中加入24609G无水乙酸钠NAAC，调PH52，加水定容至100ML，灭菌备用。4苯酚氯仿异戊醇25241，V/V5乳酸石炭酸称取乳酸比重1220G、石炭酸20G、甘油比重12540G、蒸馏水20ML。配制时先将石炭酸加热溶解，倒入水中，再慢慢加入乳酸和甘油。6戊二醛溶液称取戊二醛溶解于01MPBSPH70中，25放置4H配制成30G/L的溶液；7氯化苄、异丙醇、无水乙醇、二氯化汞升汞为分析纯试剂。22实验方法221内生真菌分离方法样品表面消毒处理为02升汞溶液浸泡LMIN无菌水冲净70酒精浸泡LMIN无菌水冲净酒精灯火焰灼烧10S。将树枝样品锯成05一1CM长的小段或完整的树叶样品切割成05X05CM大小的小方片，按上述表面消毒处理后，置于分离平板上，25黑暗培养。对照平板为未经表面消毒处理的样品直接置于平板上以及经表面处理的样品置于平板上5MIN后取出。至少培养7天后样品表面或边缘出现菌丝生长，挑取与对照平板上不同的所有种类的菌丝转接到新鲜PDA培养基上培养，待纯化后分别制成斜面4保存。根据在PDA培养基上是否产生孢子进行初步分类。222内生真菌的液体培养及抗菌试验挑取经活化的内生真菌菌丝或孢子接种于PD液体培养基中，25、120R/MIN黑暗培养，至有大量菌丝颗粒出现后作为种子液以10接种量接入新鲜PDA液体中，静置培养。5000R/MLN离心15MIN去除菌丝体，收集上清液，冷冻干燥。用适量无菌水洗下冷冻干燥的残留物，制成加倍的浓缩液，4保存待用。采用改良的平板孔阱扩散法研究发酵浓缩液的抗菌活性。将活化好的7种抗菌试验指示菌种用冷却的肉汤培养基细菌或PDA培养基真菌稀释至106CFU/ML细菌或106/ML个细胞或孢子真菌以上，倒平板。待培养基冷凝后，用直径为7MM的打孔器于平板上均匀打出三个孔，吸取10UL融化的培养基封底以防止培养基与平皿底的出现裂隙。分别吸取处理好的真菌发酵液100UL注入孔中，37细菌或25真菌下分别培养24H、96H后测量抑菌圈大小，计算平均值。223内生真菌XY28菌株DNA的提取采用改良的氯化苄法17L取01G左右冻干菌丝加液氮研磨，转移至7ML灭菌离心管中，依次加入抽提液2ML、10SDS04ML、氯化苄12ML，振荡使成乳状，50水浴L2H，其间每隔L0MIN振荡混匀一次。2加入L2ML3MNAAC，冰水浴15MIN，6000RPM离心L5MIN。3吸取上清液，加入等体积氯仿异戊醇24L轻轻颠倒混匀。9000RPM离心10MIN。4吸取上清液至干净离心管，加入081倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰箱冷冻层放置40MIN2H，可见白色絮状沉淀。510000RPM离心10MIN，弃上清，用70乙醇洗涤沉淀。加入0LML无菌重蒸水溶解沉淀。23结果和分析231银杏内生真菌的分离方法比较共分离纯化得到菌株55株，根据形态学特征进行初步鉴定，结果见表21。通过在培养基中加入孟加拉红抑制细菌和部分酵母的生长，同时采用4种不同的培养基进行分离，获得了29株菌种，其中6552在PDA培养基上为产孢真菌，且交链孢霉属、曲霉属和青霉属等环境常见菌较普遍，不产孢真菌只有3103。由于孟加拉红银杏内生菌的分离与抗菌活性菌株的分类鉴定的使用也会影响某些真菌的生长，故实验又采用了水琼脂平板，目的是建立与宿主植物内环境类似的生态模型，从而较为真实地反映植物内生菌的生物学特征，所分离的菌株中7308在PDA培养基上为不产孢真菌，实验组平板上出现的菌落明显不同于对照组，且表面消毒的样品与平板接触后无菌生长，说明表面消毒彻底，无表面菌的污染和干扰（21所示。已有的研究表明，植物内生真菌长期与宿主共存，在人工培养条件下通常为无孢菌群L8，因此本研究中水琼脂法与孟加拉红法相比更适合于内生真菌的分离22所示。图21对照组水琼脂平板分离内生其菌FIG21WATERAGARPLATESASCONTROLSA样品未消毒B样品消毒后接触图2一2水琼脂平板分离内生真菌FIG22WATERAGARPLATEWITHENDOPHYTICFUNGI表2一155株银杏内生真菌类群表TABLE22TAXAOF55ENDOPHYTICFUNGISTRAINSGINKGOBILOBA分离方法菌株编号分类群株数占总数的METHODSSTRAINSNOTAXANUMBERSPERCENTAGE孟加拉2红M129交链孢霉属1182曲霉属青霉属毛霉属链孢霉属不产孢真菌酵母6101191109118181821821636182水琼脂法YX126小单头孢霉属1182交链孢霉属简梗孢霉属不产孢真菌33195455453454232抗菌活性菌株的筛选对55株内生真菌发酵液进行抗菌试验，共筛选得到23株至少对一种指示菌的生长有抑制作用的菌株，结果见表22。选用的7株指示菌中，金黄色葡萄球菌的敏感性最强，共有20株内生菌发酵物对其生长有抑制作用，而其它指示菌相对不及金黄色葡萄球菌敏感，活性菌株分别有5株对大肠杆菌、2株对枯草芽孢杆菌、4株对白酵母、5株对红酵母、3株对青霉、4株对黑曲霉有抑制作用。具有抗菌活性的菌株占总分离菌株的4182，其中3株为交链孢霉，5株为青霉，2株为曲霉，1株为简梗孢霉，1株为小单头孢霉，其它11株为不产孢真菌，占活性菌株的4783。23株活性菌株中有20株由树枝中分离所得，占活性菌株的8696。以孟加拉红分离所得的29株菌中，有12株具有抗菌活性，占该分离方法总菌株数的4137，其中不产孢真菌4株，分别占总菌株数和活性菌株的137G、333。相比之下，以水琼脂法分离所得的26株菌中有11株具有抗菌活性，占该分离方法总菌株数的4231，其中不产孢真菌7株，分别占总菌株数和活性菌株的2692、6364，可见采用水琼脂法分离所得的抗菌活性菌株比例明显高于孟加拉红法，进一步说明了水琼脂法用于内生真菌分离的优越性，采用该方法分离所得的活性菌株值得进一步研究，分别采用形态学特征和ITS序列分析对4株产孢菌和7株不产孢菌进行分类。根据分生孢子形态对其中4株产孢菌进行鉴定，YX一2为简梗饱霉属CHROMOSPORIUMSP、YX一9为小单头孢霉属ACREMONIELLASP、YX一30和YX一45均为交链孢霉ALTERNARIASPP。表2一2银杏内生真菌发酵产物的抗菌活性TABLE23ANTIMICROBIALACTIVITYOFCULTURESOFENDOPHYTICFUNGI菌株编号分类群分离部位大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌酿酒酵母红酵母青霉曲霉M1交链孢霉树枝N19NNNNNM6青霉树枝N17NNNNNM7青霉树枝N17NNNNNM8青霉树枝N17NNNNNM11青霉树枝NNNN15NNM13青霉树枝N27NNNNNM14曲霉树枝N17N1513N13M17曲霉树枝N17N171120NM20不产孢真菌树枝NNNNNN18M23不产孢真菌树枝24NNN15NNM25不产孢真菌树枝N16NNNNNM27不产孢真菌树枝N21NNNNNYX2简梗孢霉树枝N206416NNNNYX9小单头孢霉树枝193214NNNNYX13不产孢真菌树枝N17NNN13NYX16不产孢真菌树枝N14NNNNNYX27不产孢真菌树枝N23NNNNNYX28不产孢真菌树枝23526N222N15281668YX30交链孢霉树枝N22NNNNNYX41不产孢真菌树枝2617N198NN1726YX44不产孢真菌树枝N145NNNNNYX45交链孢霉树枝1816NNNNNYX47不产孢真菌树枝N22NN1632NN由表22可看出，菌株YX一28的抗菌活性明显高于其它菌株，而且抑菌谱广，除枯草芽孢杆菌外对另外6株指示病原菌均有抑制作用，ITS序列分析显示与炭角菌XYLARIA相似，已有的研究表明这个属的真菌具有广泛的生物学活性。3讨论由于内生真菌特殊的生长环境及其多样性，在分离过程中不可避免地会造成某些菌种的丢失。主要原因有L表面消毒过头，将部分内生真菌杀死2表面消毒不充分，表面菌污染，杂菌抑制内生真菌生长3一些生长缓慢的真菌往往被生长快的真菌所覆盖4所用培养基不能保证所有内生真菌都生长。目前国内多采用抗生素平板进行内生真菌的分离，而国外一般均采用水琼脂法。传统方法一般是先进行表面消毒，然后用无菌刀片削去外部组织，将内部心材切割进行分离，由于银杏树枝木质坚硬，样品分割困难，极易造成污染，而有人研究报道树皮中也通常出现活性内生菌株，因此我们采用先分割整段树枝再表面消毒的处理，通过水琼脂法对中国古银杏样品中的内生真菌进行分离，建立与宿主植物内环境类似的生态模型，从而较为真实地反映植物内生菌的生物学特征。分离过程中设置了对照组，用于分离纯化的菌落为不同于对照组平板上的菌落，以区分内生真菌和表面杂菌，所分离的26株菌中大多为非产孢真菌19株。另外我也尝试过在培养基中加入孟加拉红抑制细菌和放线菌生长的方法，同时采用4种不同的培养基马铃薯葡萄糖培养基、玉米粉培养基、察氏培养基、酵母提取物培养基进行分离，获得了29株菌种，其中大部分是产孢真菌，且交链孢霉属、曲霉属和青霉属较普遍，而这些菌同时也是自然界中常见的病原菌或污染菌。因此，应用水琼脂法对整体样品进行分离的方法适合于银杏内生真菌的分离。内生真菌是新型生物活性物质的巨大资源。从抗菌实验结果可看出，银杏内生真菌中具有抗菌活性的菌株普遍存在，活性菌株大多集中于无孢菌群中，这个结果与相关研究一致L9。研究表明内生真菌在宿主体内产生特定的生物活性化合物，既可以有助于它在植物体生境中形成优势地位，也可以保护植物免受病原菌侵袭，因此，素有。活化石。之称的银杏几乎不感染任何病虫害的特性，不能排除是其内生真菌在发挥作用。目前,丝状真菌DNA的抽提方法主要为液氮、干冰、玻璃珠机械研磨20,21或超声、微波22,23等物理方法,氟化氢等化学试剂方法24,25,壳多糖酶、裂解酶、NOVOZ0NE等酶处理方法,以及上述方法的联合应用。但丝状真菌富含多糖的胞壁即使在液氮研磨后也难于被普通的抽提试剂破坏,而其它机械研磨方法直接破壁时不可避免会损伤到菌体释放的DNA,导致降解剧增。而以各种酶消化胞壁,既费时又昂贵,并且不总是有效26。丝状真菌的细胞壁主要以几丁质构成骨架结构,而几丁质是以N一乙酸基葡萄糖胺为单体的聚合物,它的糖链上有大量的经基。氯化苄在弱碱性条件下可以与多糖上的轻基作用生成醚,通过该反应破坏细胞壁糖链,在离子型表面活性剂SDS作用下,胞内DNA得以释放。许多内生真菌在PDA培养基或无菌的植物组织上不产生孢子。随着分子生物学技术的发展和真菌基因组数据库的不断扩大,建立在PCR基础上的新型技术被用于内生真菌的鉴定,特别是ITS序列具有较高的突变速率,己被各国研究者公认为是生物类群种间水平的比较研究中较好的指标。本研究根据形态学特征对采用水琼脂平板法分离所得的4株产孢活性菌株进行鉴定,选用585RDNA及其侧翼的ITS区域对另外7株不产孢活性菌株进行分析,585基因高度保守,适宜用于较高分类水平的系统发育分析,而ITS区域则高度变异,可以在较低分类水平上进行序列分析。根据序列相似性分析结果,银杏内生真菌菌株YX一16、YX一44与细交链孢霉ALTERNARLATENULSSIMA具有较高的同源性,另外YX一13与砖红镰孢霉FUSARIULATERITIUM、YX一27、YX一28和YX一41与炭角菌XYLARIASP、YX一47与一株分离自PICEAGLAUCA的内生菌分别具有较高的相似性,结果与形态特征比较的结果一致。内生真菌通常为无孢菌群,有的菌株即使进行相当烦琐费时的产孢诱导处理在人工培养基上也不产生有性或无性孢子,而且新的物种也在不断出现,因此内生真菌的鉴定通常比较困难。PETRINI等报道从俄勒冈州西部常绿灌木中分离出的内生真菌中有15左右不产生孢子27L。ESPINOSA一GARCIA和LANGENHEIM发现从沿海红杉中分离出的内生菌大约有269属于无孢菌群28。一些特殊的方法可用于诱导真菌产孢。GUO等对棕搁LIVISTONACHINENSIS内生真菌进行诱孢处理,将内生菌接种到含有麦芽膏培养基和无菌棕搁叶柄的三角瓶中,在紫外灯和黑暗下12H交替培养,3个月后形成了子实体29。STROBEL等将经丫射线照射过的康乃馨叶片放置于水琼脂表面,也得到了红杉内生菌的子实体结构30。本研究中银杏内生真菌YX一28菌株在固体平板上形成黑色炭化菌落,在液体或固态基质上均能形成黑色子座,通过目前已报道的各种诱导产孢手段,包括近紫外线照射、菌体扫刷、寄主接种、温差培养等处理,都未产生孢子,内生真菌生活在特殊的植物体内环境中,形成了独特的生理生化特性,在人工培养条件或即使人工接种宿主的情况下都有可能不产生孢子。因此不能依靠形态学特征对内生真菌YX一28进行准确的种的水平上的鉴定。4小结从银杏枝条、树叶样品中分离得到55株内生菌,其中29株为孟加拉红法分离所得,在PDA培养基上大部分为产孢真菌,包括1株交链孢霉、6株曲霉、10株青霉、1株毛霉、1株镰孢霉、9株不产孢真菌和1株酵母26株为水琼脂法所得,包括1株小单头孢霉属、3株交链孢霉、3株简梗孢霉和19株不产孢真菌。水琼脂法更适合银杏内生真菌的分离。通过平板孔阱实验筛选具有抗菌活性的内生真菌,共得到23株具有不同程度抗菌活性的菌株,占总分离菌株的4182。以水琼脂法分离所得菌株的活性明显高于孟加拉红方法。对用水琼脂法分离所得的11株活性菌株进行初步鉴定。根据分生孢子形态对其中4株产孢菌进行鉴定,YX一2为简梗孢霉属CHROMOSPORIUMSP、YX一9为小单头孢霉属ACREMONIELLASP、YX一30和YX一45均为交链孢霉ALTERNARIASPP。通过对ITS1一585一ITS2片段进行序列分析,结果显示YX一16、YX一44与交链孢霉ALTERNARIASPP、YX一13与镰孢霉FUSARARIUMSP、YX一27、YX一28和YX一41与炭角菌XYRIASPP、YX一47与一株分离自PICEAGLAUC的未鉴定的内生菌分别具有较高的相似性,结果与形态特征比较的结果一致。致谢本文是在阎华老师悉心指导下完成的，从论文选题、实验设计到实验材料的采集、实验的实施、论文的撰写，导师都倾注了大量的心血，老师学术上严谨的治学态度，对实验操作的严格要求以及对科学真理的执着追求的精神，一直鞭策激励着我，这将使我受益终身，在此向老师表示由衷的感谢在论文期间，湖北文理学院化学工程与食品科学学院的余海中、孙永林、张火云等老师都给予我热情的指导，并帮我解决实验过程中遇到的困难；另外在实验过程中还得到本实验室同学石银、许为、李雪梅、胡瑛莹的热情支持和帮助，在此一并向他们表示衷心的感谢感谢化学工程与食品科学学院各位领导、老师在大学四年里对我的谆谆教导、关心支持参考文献1STONEJKBACONCW，WHITEJFANOVERVIEWOFENDOPHYTICMICROBESENDOPHYTISMDEFINEDBACONCW，WHITEJFJRMIEROBIALENDOPHYTESNEWYORKMARCELDEKKER，20003292BACONCW，WHITEJFMICROBIAIENDOPHYTES,MAREELDEKERINENEWYORK，20003刘芸，殷红，彭辉等植物内生真菌一潜在的天然药物新来源J中华现代中西医杂志，2005，354044054HOVELANDCSIMPORTANCEANDECONOMICSIGNIFICANCEOFTHEACREMONIUMENDOPHYTESTOPERFORMANCEOFANIMALSANDGRASSPLANTJAGNICECOSYSTEMSENVIRON，1993，44125杜慧娟药用植物抗菌内生菌的分离鉴定及其生物学性质的研究D重庆重庆大学硕士学位论文，20086邹文欣，谭仁祥植物内生菌研究进展J植物学报，2001，4378818927梁宗琦真菌次生代谢产物多样性及其潜在应用价值J生物多样性，1999，721451508LUH，ZOUWX，MENGJC，ETALNEWBIOACTIVEMETABOLITESPRODUCEDBYCOLLETOTRICHUMSP，ANENDOPHYTICFUNGUSINARTEMISIAANNUAPLANTSCIENCE，2000，1516739LYONSPC，EVANSJJ，BACONCWEFFECTSOFTHEFUNGALENDOPHYTEACREMONIUMCOENOPHIALUMONNITROGENACCUMULATIONANDMETABOLISMINTALLFESCUEPLANTPHYSIOLOGY，1GG0，G272673210CLAYK，CHEPLICHGP，WRAYSWIMPACTOFTHEFUNGUSBALANSIAHENNINGSIANAONTHEGRASSPANICUMAGROSTOIDEESFREQUENCYOFINFENCTION，PLANTGROWTHANDREPRODUCTION，ANDRESISTANCETOPESTSOECOLOGIA，1G8G，8037438011GUERNEYKA，MANTLEPGBIOSYNTHESISOF1NMETHYLALBONOURISHBYANENDOPHYTICSTRPTOMYCESSP，JOURNALOFNATURALPRODUC，1GG3，5611G411G812STROBELGA，LIJY，SUGAWARAF，ETALOOCYDINA，ACHLORINATEDMACROCYLICLACTONEWITHPOTENTANTIOOMYCETEACTIVITYFROMSERRATIAMARCESCENSMCROBIOLOGY，1GGG，1453557356413STROBELGA，TORCZYNSKIR，BOLLONAACREMONIUMSPALEUCINOSTATINAPRODUCINGENDOPHYTEOFEUROPEANYEWTAXUSBACCATAPLANTSCIENCE，1GG7，128G710814WILFORDMHSTUDYINGTHEFUNGUSAMONGUS，BRIGHAMYOUNGMAGAZINE，SPRING1GG815申屠旭萍，俞晓平，夏湛恩，等一株银杏内生真菌代谢产物抗菌活性初步研究植物保护，2006，32355一516许灵波，申屠旭萍，陈宵峰，等银杏内生真菌NO1028的培养条件及其代谢产物对作物真菌病害的抑制作用菌物研究，2006，4225一2G17BAARDSETHP，VONELBEJHEFFECTOFETHYLENE，FREEFATTYACID，ANDSOMECHLOROPHYLLDEGRADATIONJOURNALOFFOODSCIENCE，1989，541361136318COLLINSCHMICROBIOLOGICALMETHODSSECONDEDITION，LONDONBUTTERWORTHS，196719PELAEZF,COLLADOJ,ARENALF,ETALENDOPHYTICFUNGIFORMPLANTLIVINGONGYPSUMSIOLSASASOURCEOFSECONDARYMETABLITESWITHANTIMICROBIALACTIVITYMYCOLOGICALRESEARCH,1998,10275576120LECELLIERG,SILARPRAPIDMETHODSFORNUCLEICACIDSEXTRACTIONFORMPETRIDISHGROWNMYCELIACURRENTGENETICS,1994,2512212321HAUGLANDA,HECKMANJL,WYMERLJEVALUATIONOFDIFFERENTMETHODSFORTHEEXTRACTIONOFDNAFROMFUNGALCONIDABYQUANTITATIVECOMPETITIVEPCRANALYSISJOURNALOFMICROBIALMETHODS,1999,3716516722PORTEOUSLA,ARMSTRONGJK,SEIDLERRJ,ETALANEFFECTIVEMETHODTOEXTRACTDNAFROMENVIRONMENTALSAMPLESFORPOLYMERASECHAINREACTIONAMPLIFICATIONANDDNAFINGERPRINTANALYSISCURRENTMICROBIAL,1994,2930130723BIRN,PALIWALA,MURALIDHARK,ETALARAPIDMETHODFORTHEISOLATIONOFGENOMICDNAFROMASPERGILLUSFUNIGATUSPREPARATIVEBIOCHEMISTRYANDBIOTECHNOLOGY,199517118124OSHIROS,KATSURAN,KITADAK,ETALASIMPLEMETHODFOREXTRACTIONOFDNAFROMFUNGIANDYESTSWITHANHYDROUSHYDROGENFLUORIDEFEBSLETTERS,1987,2208338625ALIJANABISM,MARTINEZI,UNIVERSALANDRAPIDSALTEXTRACTIONOFHIGHQUALITYGENOMICDANFORPCRBASEDTECHNIQUESNUCLEICACIDSRESEARCH,1997,254692469326VANBURIKJA,SCHRECKJISERW,WHITETC,ETALCOMPARISONOFSIXEXTRACTIONTECHNIQUESFORISOLATIONOFDNAFROMFILAMENTOUSFUNGIMYCOLOGY,1998,3629930327PETRINIO,STOEJK,CARROLLFEENDOPHYTICFUNGIINEVERGREENSHRUBSINWESTERNOREGONAPRELIMINARYSTUDYCANADIANJOURNALOFBOTANY,1982,6078979628ESPINOSAGARCIAFJ,LANGENHEIMJHTHEENDOPHYTICFUNGALCOMMUNITYOFACOASTALREDWOODPOPULATIONDIVERSITYANDSPATIALPATTERNSNEWPHYTOLOGIST,1990,116899729GUOLD,HYDEKD,LIEWECYAMETHODTOPROMOTESPORULATIONINPALMENDOPHYTICFUNGIFUNGALDIVERSITY,2000,110911330STROBELG,YANGX,SEARSJ,ETALTAXOLFROMPESTALOTIOPSISMICRSPORA,ANENDOPHYTICFUNGUSOFTAXUSWALLICHIANAMICROBIOLOGY,1996,142435440AGANEMPLOYMENTTRIBUNALCLAIEMLOYMENTTRIBUNALSSORTOUTDISAGREEMENTSBETWEENEMPLOYERSANDEMPLOYEESYOUMAYNEEDTOMAKEACLAIMTOANEMPLOYMENTTRIBUNALIFYOUDONTAGREEWITHTHEDISCIPLINARYACTIONYOUREMPLOYERHASTAKENAGAINSTYOUYOUREMPLOYERDISMISSESYOUANDYOUTHINKTHATYOUHAVEBEENDISMISSEDUNFAIRLYFORMOREINFORMU,TAKEADVICEFROMONEOFTHEORGANISATIONSLISTEDUNDERFURTHERHELPEMPLOYMENTTRIBUNALSARELES