大鼠脑出血致多器官功能障碍综合征模型下丘脑、延髓内脏带与迷走神经作用机制研究

大鼠脑出血致多器官功能障碍综合征模型下丘脑、延髓内脏带与迷走神经作用机制研究分类号LR743学校代码L10422密级，学号I200712904厶茹办署硕士学位论文NRIMASTERSTHESISSHAND0NUIVESGTY论文题目大鼠脑出血致多器官功能障碍综合征模型下丘脑、延髓内脏带与迷走神经作用机I一，制研究THEMECHANISMOFANDNERVEHYPOTHALAMUS，MVZVAGUS0NMODEINDUCEDOELINOUCEMULTIPLEMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONDYSLUNCTLONSYNOROMEYNDROMEVYCEREBRALOFRATSHEMORRHAGE专L“KH，J_导2011年5月9日本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名堡型EL期翌4关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定论文作者签名型导师签期3符号说明6前言7日青一，材料与方法15结果19讨论一22附图表一31参考文献35致谢40发表文章41CHINESEABSTRACT一1ABSTRACT一3ENGLISHSYMBOLICDESCRIPTION一一6PREFACE一7AND5MATERIALSMETHODS1RESULT19DISCUSSION一221DIAGRAM3ACCOMPANYINGREFERENCES35ACKNOWLEDGMENTS401PUBLISHEDARTICLE4一_一黼型下丘脑、延一一髓内脏带与迷走神经作用机制研究研究生贺雅婷导师郭洪志教授中文摘要目的大鼠脑出血CH致多器官功能障碍综合征MODS模型术后观察肺、肝、肾和小肠的病理改变；免疫组化法检测下丘脑FOS蛋白的表达及延髓内脏带MVZ乙酰胆碱转移酶CHAT的表达。探讨脑出血致多器官功能障碍综合征大鼠模型下丘脑、延髓内脏带及迷走神经的作用；揭示脑源性多器官功能障碍综合征CMODS时下丘脑、延髓内脏带及迷走神经的可能调控机制。方法血迷走神经刺激CHSIV组20只。2采用尾状核胶原酶08U和35IU肝素钠混合液注入法制作大鼠CH模型；迷走神经切断SDV组大鼠麻醉后行剖腹术，于胃小弯处暴露迷走神经左右两干支，在距离迷走神经各分支约5咖处用丝线结扎左右两干支并切断。迷走神经刺激SIV组大鼠手术暴露双侧颈部迷走神经；将银质电极做成套圈柄，套圈柄外侧刷绝缘漆，套圈内侧为电极面，将套圈扣住迷走神经，灌入石蜡油与周围组织绝缘，从颈部后面穿出皮肤，缝合切口。3记录大鼠脑出血术后各时相点的体温、心率、呼吸等症状和体征变化，检测血常规、肝、肾功能及心肌酶改变，光镜下观察大鼠脑出血术后24小时时相点肺、肝、肾、小肠各器官组织的病理变化并拍照，依据诊断标准判断SIRS、MODS的发生率。4应用免疫组织化学ABC法观察下丘脑FOS蛋白的表达。5免疫组化法检测延髓内脏带内乙酰胆碱转移酶CHAT的表达。的大鼠6509613只。2假手术组和SDV组肝、肾功能和心肌酶异常程度无明显差别，肝、肾、肺、肠组织病理损伤均轻。CHSDV组、CHSIV组和CH组的肝、肾功能、心肌酶异常程度以及肝、肾、肺、肠病理损伤均重于假手术组和SDV组，CHSDV组重于CH组，而CHSIV组明显轻于CH组。3CHSDV组大鼠下丘脑内FOS蛋白阳性表达明显多于假手术组9326CHSIV组486181与7425629，T423，PO01PO05。结论1下丘脑延髓内脏带迷走神经通路机制可能是脑源性多器官功能障碍综合征的特性；2迷走神经可能是脑出血致多器官功能障碍综合征的双向调节通路。关键词脑出血脑源性多器官功能障碍综合征；下丘脑；延髓内脏带；迷走神经2山东大学硕士学位论文THEMECHANISMOFANDNERVEHYPOTHALAMUS，MVZVAGUSINMODELINDUCEDMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONSYNDROMEBYCEREBRALOFRATSHEMORRHAGEYATINGPOSTGRADUATEHETEACHERGUOGUIDINGHONGZHIABSTRACTOBJECTIVETOOFTHEESTABLISHAMODELOFSYNDROMECEREBROGENICMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONRATINDUCEDCEREBRALOBSERVEOFBYHEMORRHAGETOPATHOLOGICALCHANGESLUNG，LIVER,SMALLINTESTINEANDRENALINOFFOSINTHEOFTHERATS，THEHYPOTHALAMUSEXPRESSIONIMMUNOHISTOOFCHATINTHERATSWEREEXAMINED、L，ITLLCHEMISTRYTHEEXPRESSIONVISCERALZONEOFTHERATSWEREEXAMINEDWIMIMMUNOHISTOMEDULLARYCHEMISTRYTOTHEROLEOFTHEANDINCEREBRALVAGUSHEMORRHAGECHINVESTIGATEHYPOTHALAMUS，MVZOFMODELTOTHEREVEALINGHEMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONSYNDROMEMODSRATMECHANISMOFTHEINPOSSIBLEREGULATORYCMODSMETHODS180WISTARRATSWEREDIVIDEDINT0RANDOMLYSHAMOPERATIVEGROUPNL0，SUBDIAPHRAGMATICVAGOTOMYGROUPSDVNL0，CHGROUPN220，CHSDVGROUPGIMULATIONN20ANDCHVAGUSGROUPCHSIVN220MODELWASMADEMIXTUREOF08UAND35IU2CHRATBYINJECTIONCOLLAGENASERATSANDUNDERWENTOFSODIUMINCAUDATEWEREANESTHETIZEDHEPARINNUCLEUS，SDVTWONERVEATLESSERTHEEXPOSEVAGUSGASTRICCURVATURE，TIGATELAPAROTOMYSURGERY，TOADISTANCE5MILLFROMEACHNERVE、，ITILSILKTHREADANDCUTOFFITATOFABOUTVAGUSBRANCHTOTHEOFSIVRATSATBILATERALNECKTHESILVERELECTRODEWASVAGUSEXPOSEWITHINSIDEOFTHEMADELIKEATHEOUTERHANDLERING，BRUSHRINGINSULATINGPAINT,THEISELECTRODETHENERVETHEOILINRINGSURFACE，WITHHOLDVAGUSBYRING，PURFUSEPARAFFINORDERTOMAKETHETISSUEINCISIONATLASTINSULATION，SUTUREDSURROUNDING3山东大学硕士学位论文3RECORDTHEANDOTHERRATE，RESPIRATORYRATE，WBCSYMPTOMSTEMPERATURE，HEARTANDOFTHEFUNCTIONANDENZYMESIGNSCHANGES，DETECTLIVER，RENALMYOCARDIALINTESTINETHEOFANDSMALLLUNG，LIVER,KIDNEYBYCHANGES，OBSERVEPATHOLOGICALCHANGESDETERMINEINCIDENCETOCRITERIASIRS，MODSDIAGNOSTICMICROSCOPE，TOACCORDINGRATSEXAMINED、RITLI4THEOFFOSINTHEOFTHEWEREEXPRESSIONHYPOTHALAMUSIMMUNOHISTOCHEMISTRYOFTHERATSWERE5THEOFCHATINTHEVISCERALZONEEXPRESSIONMEDULLARYEXAMINED、JI，IMIMMUNOHISTOCHEMISTRYRESULTS1INCIDENCEOFSIRSINCHANDTHECHSIVISGROUPGROUPGROUP，CHSDVOFMODSINCH1INCIDENCESOFMODSINCHISINCIDENCES70，THE00，THEGROUP65SDVISINCIDENCESOFMODSINCHSIVIS75，THEGROUPGROUPSOFANDRENALANDTHE2ABNORMALITYHEPATICFUNCTION,MYOCARDIUMENZYMEINOFINTESTINECHSDVCHANGELIVER,KIDNEY,LUNG，SMALLGROUP，CHSIVPATHOLOGICALANDTHOSEOFCHTHANANDSDVOUTWEIGHSHAMOPERATIVEGROUPGROUP，GROUPGROUPTHANWEREMUCHTHANCHSDVCHLIGHTERGROUPOUTWEIGHSGROUPCHSIVGROUPTHOSEOFCHGROUP3THEOFFOSINCHSDVWEREPOSITIVEEXPRESSIONHYPOTHALAMUSOYGROUPMUCHTHANTHOSEOFAND7，PO025士04，T811HIGHERSHAMOPERATIVEGROUP93426THANTHOSEOFANDSDVANDMUCHFEWER29士05，T764，P001，BUTGROUP93士26CHANDWEREMORETHAN486,士181，卢680，P001，CHSIVGROUPGROUP93士26THOSEOFCHAND4864181，T423，P001GROUP74254629WEREMUCH4THEOFCHATINMVZOFCHSDVEXPRESSIONGROUPPOSITIVE3849A1176AND1081THANTHOSEOF5士954，T539，HIGHERSHAMOPERATIVEGROUP1SDVANDMUCH11071士988，T483，P0OI，BUTP001ANDGROUP1384941176FEWERTHANTHOSEOFCHAND1644211244，仁353，P001，GROUP13849士1176CHSIVWEREMORETHANTHOSEOFCH893841497AND16442GROUPGROUP111244，T314，P0054山东大学硕士学位论文CONCLUSIONTHEBEDISTINCTIVEINHYPOTHALAMUSMV乙VAG岫PATHWAYMAYCMODSVAGUSBETHERATSCEREBRALANDNERVEABIDIRECTIONALCHANNELOFHEMORRHAGEMAYFOLLOWINGMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONSYNDROMECEREBRALKEYWORDSHEMORRHAGE；CEREBROGENICMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONVISCERALNERVEZONE；VAGUSSYNDROME；HYPOTHALAMUS；MEDULLARY5山东大学硕士学位论文符号说明CHCEREBRAL脑出血HEMORRHAGESIRS全身炎症反应综合征SYSTEMICINFLAMMATORYRESPONSESYNDROMEMODSMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONSYNDROME多器官功能障碍综合征MOFFAILURE多器官衰竭MULTIPLEORGANCMODSCEREBROGENICMULTIPLEORGANDYSFUNCTIONSYNDROME脑源性多器官功能障碍综合征MVZVISCERALZONE延髓内脏带MEDULLARYCHATCHOLINE胆碱乙酰转移酶AEETYLTRANSFERASESDVSUBDIAPHRAGMATICVAGOTOMY膈下迷走神经切断术SWITHNERVESTIMULATIONVAGUS迷走神经电刺激术ELECTRICITYACVDACUTECEREBROVASCULARDISEASE急性脑血管病ILINTERLEUIDN白细胞介素田NFATUMORNECROSISFACTOROR肿瘤坏死因子吨NTSNUCLEUSOFTHETRACT孤束核SOLITARY妓AREA最后区POSTREMAVLMVENTROLATERALMEDULLA延髓腹外侧部DMRDORSOMEDIAL背内侧部REGIONVLRVENTROLATERAI腹外侧部REGIONLMRINTERMEDIATE中间部REGIONDMNXDORSALNUCLEUSNERVE迷走神经背核OFVAGUSLLURETICULARNUCLEUSLATERAL外侧网状核VLRTVENTROLATERALRETICULARNUCLEUS腹外侧网状核NANUCLEUS疑核AMBIGUUSIRTINTERMEDIALRETICULARNUCLEUS中间网状核PNHNUCLEUS下丘脑室旁核PARAVENTRICULAROFHYPOTHALAMUSACHACETYRICHOLINE乙酰胆碱6山东大学硕士学位论文前言1对MODS的认识过程多器官功能障碍综合征MULTIPLEORGANDYSFUNCTION代初外科领域提出的概念，被视为人们在危重病救治认识上的飞跃。对MODS名文章，题为“70年代综合征进行性序贯性多系统器官衰竭”。随后，不同作者在复习了各自的临床资料后，不断地证实了在严重的创伤后可能最终发生类似的情况，而赋以各种不同的命名。1977年，EISEMANL2】等首先使用多器官功能衰竭MULTIPLEORGANFAILURE，MOF词，并提出了有关MOF的概念及诊断标准，此后一段时间，MOF的命名和诊断标准被普遍承认和接受。1989年BONEL3L等将因感染而引起的全身反应的临床现象称为“全身感染综合征”SEPSISSYNDROME，初步阐述了多器官功能衰竭在发生发展过程中的病理生理特征。1991年美国胸科医生学会与危重感染急救医学ACCPSCCM在芝加哥联合召开的讨论会上提出了全身炎性反应综合征SYSTEMICINFLAMMATORYRESPONSESYNDROME，SIRS的命名和定义41。认为SIRS是由感染或非感染因素刺激宿主触发炎症过度反应的结果，这些因素刺激宿主免疫系统，释放体液和细胞因子，对血管张力和渗透性产生影响，导致微循环障碍、休克或器官衰竭。临床和实验研究表明，MODS早期常表现为SIRS，其主要临床特征是继发于各种严重打击后出现的持续高代谢、高动力循环状态以及过度的炎症反应。SIRS不是一种新的疾病，而是基于对感染、炎症和危重病发生发展机制深入认识后提出的新概念。SIRS是机体对多种细胞因子和炎症介质的反应。当机体受到外源性损伤或感染毒性物质的打击时，可促发初期炎症反应，同时机体产生内源性免疫炎性因子而形成“瀑布效应”。危重病人因机体代偿性抗毒反应能力降低以及代谢功能紊乱，最易引发SIRS，严重者可导致多脏器功能衰竭。ACCPSCCM所推荐的全身炎症反应临床标准为下列两项或两项以上病症体温38“C或36；心率90次分呼吸20次分或白细胞。现在普遍认为SIRS的标准过宽，这些变化常见于住院病人，而在重症监护治疗病房中几乎可达23以上。近年来，国内外学者认为诊断成人SIRS时，除前述4项临床指标外，还应具备低灌注、高代谢及启动凝血功能异常的临床表7山东大学硕士学位论文少尿，O5M坎KGH，连续24H；乳酸酸中毒，2MMOLL；血小板减少，改变，如兴奋、烦躁或嗜睡。理解SIRS这一概念，必需强调炎症由有益的局部软组织事件受激发而变为有害的全身性事件这一关键点。同时，在美国胸科医生学会与危重感染急救医学ACCFISCCM在芝加哥联合召开的讨论会上，否定了MOF的概念和它的诊断标准，首次提出了多器官功能障碍综合征MULTIPLEORGANDYSFUNCTIONFAILURE中筋LURC一词反映的是器官功能失常的结局，是一静态的概念；而ORGANDYSFUNCTION词有由轻至重的动态含义，能较精确地反映器官功能、潜力逆转及病变进展的性质。因此，鉴于MOF既不能指一个独立疾病，又不能指单一脏器演变过程，而是涉及多个器官病理变化的复杂的综合征，是一系列病理生理变化的演变过程，故会议共同倡议将MOF更名为MODS。目的是为了纠正既往过于强调器官衰竭标准，而着眼于病理发展的全过程，更加准确地反映了此综合征进行性和可逆性的特点，更加重视器官衰竭前的早期诊断和防治。多器官功能障碍综合征MODS是指机体遭受严重感染、创伤、烧伤、休克、重症脑损伤、重症胰腺炎等损害，24D,时之后同时或顺序出现2个或2个以上器官功能不全，并达到各自器官功能障的诊断标准。即病人多个器官功能障碍已不能维持机体内环境稳定的临床综合征。中国在1995年10月的庐山全国危重病急救医学会议上【51，包括中国中西医结合学会急救医学专业委员会、中华医学会急诊医学会也决定将MOF更名为MODS，其内涵除了包括ACCPSCCM所提出的主要内容以外，还突出强调了导致器官损伤的机理，以利于与其他器官衰竭相鉴别。目前，国际和国内的学术界正逐步习惯和接受MODS这一命名。将MOF更名为MODS，体现了对该综合征更深入的了解和认识，即器官衰竭本身并不是一个独立的事件，只是一连串病理过程中的一个终末阶段，此前往往是先出现器官功能不全。虽然MODS得到众多学者的认可，但在实际运用中并未完全替代MOF，曾有MODS的病程发展过程，但并非所有MODS患者都发展到MOF。故定义其病8山东大学硕士学位论文变早期为器官功能障碍，发展至晚期为器官功能衰竭。2脑源性多器官功能障碍综合征的概念多器官功能障碍综合征无论是病因、发病机制还是临床诊疗均十分复杂，不同病因所致多器官功能障碍综合征各具特点。而脑源性多器官功能不全综合症同样应存在自身的特征和发病机制【6】。脑源性多器官功能障碍综合征CMODS是近年郭洪志教授与多位青年学者共同努力经过十几年潜心研究后，确立的新概念。那么什么是脑源性多器官功能障碍综合征CEREBROGENICMULTIPLEORGANDYSFUNCTION多器官功能障碍综合征CMODS是由于脑的急性功能损害后所直接导致的脑以外2个或2个以上的器官同时或序贯发生的功能障碍，进一步发展可导致MOF，引起死亡。脑源性多器官功能障碍的必备条件三项1严重的中枢神经系统急性疾病，如急性脑血管病，严重颅脑外伤，癫痫持续状态，严重的颅内感染等。2临床表现及实验室检查显示全身炎症反应综合征的迹象1991年美国胸科医师协会制定的SIRS诊断标准。3重症急性中枢神经系统疾患发病后7天内、发生器官功能障碍，并排除其它原因引起。脑源性多器官功能障碍综合征选项条件具备下列条件两项以上1心血管功能障碍低心排血量、微循环不足表象、低血压、心脏指数小于15LM2，需用药物或机械辅助来维持循环。2肺功能障碍呼吸节律规则异常、低氧血症、高碳酸血症，应用药物和辅助呼吸一天以上来维持气体交换。3肝功能障碍血清胆红素大于3429RNOLL，肝谷草及谷丙转氨酶浓度大于正常值两倍以上，血清白蛋白含量减少，白蛋白球蛋白比例持续倒置，以及肝昏迷相应的表现。4肾功能障碍无论病人当时的尿量多少，凡是血肌酐持续大于2001ANOLL以上即为肾功能障碍。5胃肠功能障碍胃肠道不能正常蠕动，不能口服维持营养，严重腹胀，极不想进食，或胃肠粘膜发生急性糜烂和应激性溃疡或出血。6凝血功能障碍凝血因子合成障碍或消耗过多而导致缺乏，血液不能自凝或弥漫性血管内凝血DIC。7持续性的高代谢代谢率可达到正常的15倍以上，即使静息也不能降低，耗能途径异常。近年，人们在早期实验室诊断方面致力于寻找能反映器官功能障碍或提示器官损伤的有早期预警意义的指标，这些指标一般都是测定一些器官的标志酶或特定的代谢物质。目前已提出来的有诊断肺损伤的指标，血管紧张素转换酶和凝9山东大学硕士学位论文血因子相关抗原；反应心肌损伤的指标如心肌酶谱测定；反应肝功能的前自蛋白和视黄醇结合蛋白、胆红素的亚成分、吲哚化合物清除试验、苯丙氨酸以及酮体比例；反应肠粘膜损伤的有双胺氧化酶DAO、D乳酸、乳果糖甘露醇通透实验以及胃、肠粘膜内PH测定等指标与代谢有关的如白介素L、3甲基组氨酸、支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值、组织氧债等；与过度炎症和免疫反应有关的助于MODS的早期诊断，它们对于MODS有预警价值，同样对于CMODS也有预警价值。脑源性多器官功能障碍综合征CMODS是神经内科常见的危重综合征，尤其多见于急性脑血管病、癫痫持续状态、重症脑炎等。临床上表现为发病机制复杂，发展快速，死亡率高，但经过恰当治疗在脑功能好转后，受损害的器官也有部分能好转的临床综合征，而不可单纯认为是脑部病变的并发症，因为并发症是个模糊的概念，因果关系不明确，不能反应因果关系。临床研究有报道MODS在急性脑血管病后发生率约为1121。没有发生MODS的单纯ACVD病人死源性MODS是ACVD病人死亡的最主要的原因。同时，ACVD也只是脑源性多器官功能障碍的各种原因之一，还有癫痫持续状态、脑外伤、脑部感染等均可导致脑源性多器官功能障碍，已有少量文献报道；然而，在危重病学领域深入研究MODS的时代，神经内科学领域对这种常见又严重的综合征关注不够，临床系统研究和基础系统研究也寥寥无几。国内首次有关ACVD后CMODS的临床研究于1991年郭洪志等首次报道71，并随之进行了一系列的临床实验研究1835】。主要内垂体_三个靶腺轴肾上腺、甲状腺、性腺功能异常；T霪ACVD致MODS时肾素_血管紧张素_醛固酮系统的功能紊乱和分泌相关激素的改变；变ACVD致MODS时心钠素异常与MODS的机制研究。并通过临床观察研究提出了ACVD致MODS的特点病人获病年龄均偏高，多数在60岁以上，常伴有高血压、冠心病、慢性支气管炎、肺气肿及其它系统慢性疾病等特点。脑部原发疾病重。三个以上器官同时受累居多，功能障碍器官以肺、心、胃肠多见。国内外有关ACVD致MODS的基础研究，郭洪志教授等首次报道于2003年【引，LO山东大学硕士学位论文主要研究内容涉及大鼠脑血管病致MODS的四种模型的建立。四种大鼠CMODS模型包括A大鼠全脑缺血致MODS模型；B大鼠局限脑缺血致MODS模型C大鼠脑出血致MODS模型；D大鼠蛛网膜下腔出血致MODS模型的。确立了实验动物时脑源性MODS的存在，获得了各脏器功能障碍的病理和功能异常实验依据。随着神经科领域对于CMODS关注度在上升，很多临床工作者已经意识到脑功能急性损害所引起的多器官功能障碍CMODS，不是简单的并发症问题，还有其特殊性和根源性，患者预后与多器官功能损害情况有直接关系，随着脑功能的好转，多器官功能可逐渐恢复，已经开始有不少相关临床分析报道。深入探讨ACVD、脑外伤等脑部原因致MODS的确切发病机制，研究ACVD、脑外伤等后如何对MODS进行早期诊断和防治是当前迫切需要解决的问题。3CMODS神经内分泌免疫网络研究既然脑源性多器官功能障碍综合征是MODS的重要分支，那么，其发病机制和临床特征上既应存在MODS的共性，也更应存在其独特的个性。31ACVD时下丘脑和垂体的病理生理大量研究证实，ACVD时下丘脑不同程度损害是肯定的，因此，下丘脑以其独特的解剖结构和复杂的生理功能，成为ACVD致MODS研究的热点。它作为神经系统和内分泌系统的连接点，在神经内分泌免疫网络研究中占有极为重要的地位。下丘脑不仅通过神经神经、神经体液通路与垂体发生直接的联系，以兴奋与抑制两种不同的机制维持垂体内分泌的相对恒定，而且通过与中枢神经系统各个区域密切联系的各种神经纤维，与脑干网状结构、皮质、边缘系统等共同调节全身各器官的生理活动。下丘脑的神经细胞具有双重功能，既能传导神经冲动，又有分泌特征。实验研究证实，下丘脑接受由边缘系统海马、杏仁、隔区等、皮质、丘脑和网状激活系统等的刺激神经输入，几乎与脑的全部区域都存在密切联系，并随时都能触发神经内分泌细胞分泌释放因子，再经由垂体神经通路或垂体门脉系统输送，从而促使垂体的分泌细胞分泌各种促激素，随时控制调节全身各靶腺激素的代谢。ACVD时丘脑下部的病理改变到底如何，近年来国内外学者有众多的报告，学者们发现丘脑下部的视交叉、漏斗及乳头体等在镜下见到组织疏松呈网眼状，各个神经核视上核、室旁核、乳头体核等均有不同程度山东大学硕士学位论文的坏变包括细胞轮廓不清，染色质溶解、消失或不规则凝集，有时空泡形成、核移位小血管有玻璃样变和钙化，有的第三脑室壁室管膜上皮脱落，附近出现多数吞噬含铁血黄素细胞。重者还见到下丘脑的视前核、室旁核、弓状核、漏斗核、灰结节核坏死。32ACVO时神经免疫调节回路异常神经和内分泌系统可以影响和调节免疫功能，免疫系统也可以反馈性地影响神经和内分泌功能，形成一个完整的调节回路。神经免疫调节的研究为ACVD致MODS的诊治和预防开辟了一个新的领域，虽然目前这方面的材料还不多，但已充分显示出它的广阔前景，在理论和临床上有很多值得深入的问题。学者们开始等对下丘脑一垂体一肾上腺轴的调节方面作了一系列工作。研究发现，给动物注射绵羊红细胞作为抗原，可使血中肾上腺皮质激素的含量升高。在免疫反应达到高峰时，糖皮质激素的水平也达最高峰，两者有平行关系。切除动物垂体可阻止这种反应。进一步的实验表明，以刀豆素CONA刺激淋巴细胞转化，以其上清液给大鼠注射，发现血中糖皮质激素的含量也升高。免疫细胞本身也可以产生和释放某些激素，如ACTH、促甲状腺素等，这些激素作为免疫细胞在免疫反应中释放的活性因子再作用到神经和内分泌系统起反馈调节作用。另外，免疫细胞产生的细胞因子，如白细胞介素系列IL1、6、肿瘤坏死因子TNF、干扰素等均作为免疫调节物质发挥重要作用，并且对神经和内分泌系统的调节作用明显，可能是神经免疫调节回路中的一类重要介质。我们认为，ACVD时异常的下丘脑一垂体靶腺轴肾上腺、甲状腺、性腺等系统，必将对免疫系统及炎性介质产生广泛的正、负反馈调节，形成异常的与MODS发生、发展有关的神经免疫调节回路。总之，以上各研究结果均证实，无论从哪一个神经内分泌免疫调节轴来探究异常即神经免疫调节回路异常密切相关。不可否认，下丘脑作为重要的应激反应调控中枢，在神经内分泌免疫网络中具有举足轻重的地位，它不仅通过神经神经、神经体液通路与垂体直接发生联系，还通过神经传导纤维与脑干网状结构、皮质、边缘系统等共同调节全身各器12山东大学硕士学位论文官的生理活动。随着化学神经解剖学的飞速发展，有学者研究发现在各种应激情况下，下丘脑与作为“生命中枢”的延髓有着密切的联系，已证实在大鼠延髓中尾段的横切面上，存在一条从背内侧至腹外侧的弧形带状区，称之为延髓内脏带VISCERALZONE，MVZ，MVZ作为一重要的机能结构区，通过各核团之MEDULLARY间的内在与外在纤维联系，参与各种躯体性、内脏性感觉和内脏活动的调节如呼吸、心跳、血压、胃肠活动、内分泌以及免疫反应等，是另一重要的应激反应调控中枢。长期以来，延髓作为重要的生命中枢，国内外学者多局限于研究其中某一核团的生理、病理功能，而忽略了延髓对机体生命的整体调节。目前MVZ在国外研究甚少，在国内神经解剖学领域逐步得到认识，而在神经内科领域普遍了解甚少。JIAT38】等在研究大鼠延髓至前脑伏核、中央杏仁核的投射中发现无论将辣根过氧化物酶HRP注入前脑伏核还是中央杏仁核，结果其HRP逆行标记细胞和顺行标记纤维均分布于延髓中、尾段一条从背内侧经网状结构至腹外侧的弧形带状区内，因此提出了延髓内脏带这一新概念。该带包括背内侧部的最后区、孤束核、迷走神经背运动核，腹外侧部的疑核、腹外侧网状核、外侧网状核和位于二者之间的中间网状带。在人、猴延髓也发现存在MVZ，当前MVZ已被国际学术界认可。有研究显示MVZ与MODS各器官损伤密切相关。延髓内脏带通过迷走神经与外界发生联系。迷走神经内含有大量的副交感神经纤维。其活性一方面在于保护机体、休整恢复、促进消化、积蓄能量。另一方面作用于免疫细胞，刺激抗炎因子的产生，抑制炎性因子的合成与释放，最终起到抗炎的作用。ACVD后发生全身炎症反应SIRS可引起致炎因子释放，适当的炎症反应有利于消灭细菌、清除坏死组织、促进修复及伤口的愈合。若致炎因子大量释放，则引起过度炎症反应，进一步引起多个器官的损伤。为了防止过度炎症，机体本身亦产生内源性的抗炎因子和抗炎反应，如果抗炎因子释放量不足，也可导致炎反应的进一步扩大发展。以往的研究较多关注体液因素或细胞因子的自分泌和旁分泌对抗炎或促炎介质释放的影响，近年来“神经内分泌”抗炎通路逐渐成为研究热点，其中迷走神经及其递质乙酰胆碱具有重要的作用。由此可见下丘脑，MVZ和迷走神经与CMODS的发生发展密切相关。本研究旨在通过建立大鼠脑出GLTCH致多器官功能障碍综合征MODS模型；观察大鼠脑出血术后生命体征、肝肾功能、心肌酶异常程度及肺、肝、小肠和肾组织的病理改变及血浆内毒素的变化；免疫组化法检测下丘脑FOS蛋白的表达及延髓内脏带MVZ乙酰胆碱转移酶的表达。探讨脑出血致多器官功能障碍综合征大鼠模型下丘脑、延髓内脏带及迷走神经的作用；揭示脑源性多器官功能障碍综合征CMODS时下丘脑、延髓内脏带及迷走神经的可能调控机制。本研究在多年临床和实验研究的基础上，探讨CMODS的发生机制注重揭示ACVD后下丘脑、延髓内脏带和迷走神经的作用，探讨ACVDMVZ迷走神经肠道内毒素异位迷走神经延髓内脏带下丘脑神经内分泌免疫改变全身炎症反应综合征MODS病理循环通路的神经调控机制，为今后实施干预来防治CMODS提供理论依据。14山东大学硕士学位论文材料与方法1动物与分组成年健康雄性WISTAR大鼠清洁级80只，质量250300G，由山东大学实验动物中心提供。用随机数字表将大鼠分组假手术组10只迷走神经切断SDV组10只脑出血CH组20只脑出血迷走神经切断CHSDV组20只脑出血迷走神经刺激CHSIV组20只2试剂与仪器1试剂1兔抗FOS抗体武汉博士德生物有限公司；2生物素标记的羊抗兔IGG3生物素卵蛋白辣根过氧化酶复合物；4兔抗乙酰胆碱转移酶抗体以上均购自武汉博士德有限公司5VII型胶原酶SIGMA公司。2仪器1江湾IC型脑立体定向仪；2微量注射器上海倍曼生物科技有限公司产品；3离心机日本日立公司产品；4全自动生化分析仪日立公司7010型产品；5光学显微镜日本OLYMPUS公司产品；6切片机上海倍曼生物科技有限公司产品7恒温水浴箱美国FORMA驻上海雷勃分析仪器有限公司产品；8照相显微镜日本OLYMPUS公司产品；山东大学硕士学位论文3模型制作TH。以L戊在室温22及恒定湿度的条件下，大鼠术前禁食12H，禁水4巴比妥溶液40MGKG腹腔注射麻醉。麻醉动物后，调整脑立体定向仪，使门齿钩平面比耳间线平面低24MM，将大鼠俯卧固定在立体定向仪上，此时前囟和后NULL，囟基本在同一平面上，沿矢状缝切开头皮，暴露前囟及冠状缝，于前囟前O2中线右侧旁开3II吼，用牙科钻钻一直径约151111“1“1的圆孔，深度达硬脑膜表面，不伤及脑组织。在立体定向仪的引导下，用微量注射器针头直径约06MM沿钻孔垂直进针6MN，CH组注入VII型胶原酶08U和35IU肝素钠混合液2M，留针10MIN后缓慢退出。假手术组注射等体积生理盐水，其余步骤同实验组。神经功能评分按ZEALONGA评分法0分，无神经损伤症状1分，不能完全伸展对侧前或后爪；2分，向手术对侧转圈；3分，向手术对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。4SDV及SIVS1SDV大鼠麻醉后行剖腹术，于胃小弯处暴露迷走神经左右两干支，在距MM处用丝线结扎左右两干支并切离迷走神经各分支胃支、肝支和腹腔支约5断。2SIV组大鼠麻醉后，大鼠仰卧固定于操作板上，备皮，在喉头与胸骨之间沿颈腹正中线做长约20MM的切口，用止血钳逐层撕裂分离，将胸骨舌骨肌与胸骨甲状肌分开，即可暴露气管及双侧颈动脉鞘内有颈动脉及颈部神经。持蚊式止血钳及玻璃分针顺着血管走向钝性分离颈总动脉和迷走神经。将银质电极做成套圈状，套圈柄及外测刷绝缘漆，套圈内侧为电极面，将套圈扣住迷走神经，灌入石蜡油与周围组织绝缘，后从颈部后面穿出皮肤，手术切口再缝合。引出的导线备电刺激时连接刺激器。动物存活4周后行脑出血术。术后24小时内给予5V，2MS和1HZ、2MS强度的持续电刺激迷走神经20分钟，每4小时一次，共6次。5采血及一般项目检查1观察术后各时相点动物的一般情况，包括意识、精神状态、肢体活动等。2观察术后各时相点动物的体温、呼吸、心率改变。3术后在各时相点将动物麻醉后，常规消毒皮肤，颈静脉抽血5ML，立即送16山东大学硕士学位论文化验室检测如下指标血常规检查丙氨酸转氨酶ALT天门冬氨酸转氨酶AST尿素氮BUN肌酐CR乳酸脱氢酶LDH6病理学检查迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至升主动脉根部，先以LOOML生理盐水快速灌注，之后稍缓慢灌注至流出液清亮，换4多聚甲醛200ML快速灌注，之后稍缓慢灌注继续固定，灌注约30分钟至动物四肢变硬。注毕立即取脑、肺脏、肝脏、小肠、肾脏，观察大体标本的形态变化，随后脑放入4多聚甲醛溶液内及时固定，其余脏器放入盛有10中性福尔马林的容器内及时固定。冰冻切片机连续冠状切片，行HE染色。光镜下观察肺脏、肝脏、肾脏、小肠组织病理改变。7下丘脑FOS蛋白表达L对留取的下丘脑，采用免疫组织化学染色法ASC法检测下丘脑FOS蛋白组织标本常规脱水、蜡染、包埋、切片，片厚30UM，隔六张取一张；X一100的PBS浸泡30分钟室温切片先入含39LTDTON洗LO分钟3次；漂洗LO分钟3次；漂洗10分钟3次；最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸铵法呈色，切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封固，光镜下观察并摄片；免疫组化替代试验CH组大鼠部分延髓切片，用001MOLLPBS取代抗FOS第一抗体，再按ABC法进行免疫组化染色；17山东大学硕士学位论文的总和，而后在每组动物间取均数。8延髓内脏带MVZ内CHAT表达组织标本常规脱水、蜡染、包埋、切片，片厚30UM，隔六张取一张X100孵育30MIRA391TRITONMIRA2牛血清白蛋白BSA孵育40兔抗CHATIGG1504孵育过夜；2BSA孵育40MIN；生物素化的羊抗兔IGG室温孵育2HABC武汉博士德孵育2H，上述各步之后PBS漂洗10MIN3次；葡萄糖氧化酶DAB硫酸铵法呈色，切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封固，光镜下观察并摄片。对照片用PBS取代一抗。阳性神经元的单位面积内的平均灰度值。性细胞进行图像分析，得出每个视野阳性神经元的数密度，并进行定量分析。9统计学方法实验数据以均数4标准差XKS表示，应用SPSSIO0统计软件进行处理，组间均数比较采用方差分析，两组间比较采用T检验。18山东大学硕士学位论文结果依据盛志勇院士制定的动物SIRS和MODS的诊断标准见表L、2。动物SIRS的标准为直肠温度较正常或伤前升高或降低O8“C；呼吸频率超过对照值2倍或PAC02低于对照值的75；白细胞总数超过对照值的2倍或减少50；心率较对照值增加50。若实验条件许可，持续监测动物的血流动力学和氧代谢指标的变化以及炎症介质的水平，可以更全面和精确地判断SIRS发生的时间和程度。H死亡8只；CHSDV组符合MODS15只的大鼠14只70厶，未到术后2475O，未到时相点死亡LO只；CHSW组符合MODS13只650，未到时相点死亡7只。2各组大鼠呼吸、心率、体温及外周血WBC检测结果2见表3假手术组与SDV组相比，其呼吸、心率、体温及外周血WBC的差异无统计学意义，CH组的上述各项指标均高于假手术组、SDV组。3各组大鼠肝功能、肾功能、心肌酶学检测结果比较见表4。指标则比CH组和CHSDV组明显降低。4各组大鼠肺，小肠、肝脏、肾脏病理改变1假手术组大鼠各器官组织结构基本正常。2SDV组大鼠肺组织正常，小肠黏膜层水肿、增厚，肝脏组织见少量肝细胞水肿，肾组织见近曲小管上皮细胞水肿，胞浆空泡样变。3CH组大鼠肺毛细血管明显扩张充血，血管腔内可见中性粒细胞增多，肺泡腔内及血管周围可见纤维蛋白渗出，轻度慢性淋巴细胞性支气管肺炎改变。小肠黏膜和黏膜下层水肿、增厚，轻度炎细胞浸润肝组织中肝细胞水肿、轻度点状坏死，肝窦扩张，个别肝细胞呈气球样变，部分肝细胞嗜酸性变。肾脏出现肾19山东大学硕士学位论文小管扩张，近曲小管上皮细胞肿胀。4CHSDV组大鼠脏器病理改变均较CH组明显，小肠黏膜和黏膜下层水肿、增厚，大量粒细胞浸润；肝细胞可出现明显点状坏死；肾脏肾小球萎缩及近曲小管上皮细胞肿胀、坏死；肺泡腔内可见明显纤维蛋白渗出，出现支气管肺炎改变。5CHSIV组大鼠肺脏、小肠、肝脏、肾脏非特异性炎性改变均较CH组和CHSDV组轻。大鼠肺毛细血管扩张充血，血管腔内可见少量中性粒细胞。小肠黏膜和黏膜下层水肿、增厚；肝组织中肝细胞水肿、肝窦扩张，个别肝细胞呈气球样变。肾脏出现肾小管扩张，近曲小管上皮细胞肿胀。5下丘脑FOS蛋白阳性细胞变化1假手术组下丘脑内有少数浅染FOS蛋白阳性细胞，SDV组下丘脑内FOS蛋白阳性细胞数较假手术组略多，但差异无统计学意义29士O5与2504，T197，P005。较CH组明显减少93426与486士181，T680，P001。P001明显增多。6各组大鼠MVZ内CHAT阳性表达T059，P005。1071士988，TFFI483，10815士954，T539，P001和SDV组13849士1176与L主要集中在NTS、DMNX和VLRT。山东大学硕士学位论文T495，P001明显增多，主要位于DMNX、NA、NTS和VLRT。2L山东大学硕士学位论文讨论一多器官功能障碍综合征危重病学与创伤外科学者研究认为，多器官功能障碍综合征MULTIPLEORGANDYSFUNCTION时或序贯地出现2个或2个以上器官或系统功能不全，并达到各器官功能障碍的诊断标准【4】。MODS的发病机制非常复杂，广泛涉及神经、体液、内分泌、免疫与代谢等多个方面，其病程演变可简单表示为原发损伤_机体应激反应_全身INFLAMMATORY炎症反应综合征SYSTEMICRESPONSEMOF_死亡。MODS在急性脑血管病后发生率为L121，并发MODS者死MODS的机体应激反应环节具有自身的特异性，因为它的原发灶是直接损伤了大脑，从脑的局部损伤如何引发起全身SIRS致MODS是本研究的目的，对此国内外没有参考资料。二下丘脑与脑源性多器官功能障碍综合征大量研究证实，ACVD时下丘脑存在不同程度的损害，因此，下丘脑以其独特的解剖结构和复杂的生理功能，成为ACVD研究的热点。它作为神经系统和内分泌系统的连接点，在神经内分泌免疫网络研究中占有极为重要的地位。下丘脑不仅通过神经神经、神经体液通路与垂体发生直接的联系，以兴奋与抑制两种不同机制维持垂体内分泌的相对恒定，而且通过与中枢神经系统各个区域密切联系的各种神经纤维，与脑干网状结构、大脑皮质、边缘系统等共同调节全身各器官的生理活动。下丘脑的神经细胞具有双重功能，即能传导神经冲动，又有分泌特征。BESEDOVSKYL39L等对下丘脑一垂体肾上腺轴的调节方面作了一系列工作。研究发现，给动物注射绵羊红细胞作为抗原，可使血中肾上腺皮质激素的含量升高。在免疫反应达到高峰时，糖皮质激素的水平也达最高峰，两者有平行关系。国内最早有关ACVD致MODS的临床特点及下丘脑神经内分泌激素的异常变化的研究始于1991年郭洪志等的报道【71，郭洪志等系统研究了各种ACVD时下丘脑垂体靶腺轴、肾素血管紧张素醛固酮系统的功能紊乱和相关激素的改变，研究认为ACVD致MODS时出现上述神经内分泌激素的持续异常分泌，可作为山东大学硕士学位论文早期发现ACVD致MODS的预警指标。神经解剖学研究已证实，下丘脑部分室周纤维下行至中脑续入背侧纵束，经网状结构的转换可达脑干的副交感神经核即迷走神经背核，在此换元后，通过迷走神经调节胃肠道的分泌和运动功能，下丘脑损伤后，可出现胃溃疡和出血等症状。ACVD时下丘脑病变的原因可能有血肿穿破脑室，血液经过第三脑室直接侵袭了下丘脑；窑ACVD时的脑水肿、颅内压增高、甚或脑疝形成，压迫下丘脑导致损伤；ACVD后中线结构受损，下丘脑向下移位直接压迫漏斗或漏斗柄时，血液循环障碍使垂体门脉循环受阻造成充括出血性与缺血性的脑血流量，发现全脑和下丘脑血流量下降，下丘脑有缺血性损伤。下丘脑的神经细胞具有双重功能，即能传导神经冲动，又有分泌特征。神经分泌细胞和一般神经细胞一样，都能对神经冲动产生兴奋性和对神经递质产生反应，且能传导动作电位。但它们与神经细胞又有一定区别，即传出的不是神经冲动，而是激素样物质后者不象神经递