复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究(可编辑)

复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究中山大学硕士学位论文复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究艳印中山大学北校区基础医学院药理教研室专业名称药理学硕士研究生陈湘萍导师姓名朱邦豪副教授答辩委员会主席循交曲订答辩委员会委员年月中文摘要复方灯蘸花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究专业药理学硕士研究生陈湘萍导师朱邦豪副教授摘要研究目的本课题拟通过不同比例的灯盏花素与大黄进行增效减毒、科学配伍,观察其对链脲佐菌素,诱导的糖尿病大鼠动物模型肾脏的保护作用并探讨其可能的机制,为糖尿病肾病,的防治提供种安全、有效且价廉的中药提取物。研究方法将只正常雄性、矾大鼠一次性羧腔注射诱导成糖尿病后,随机分为组,分别为糖尿病对照组只、卡托普利治疗组,虹只、大黄治疗组孙,只、灯盏花素治疗组班只、灯盏花素大黄治疗组,/垤只、灯盏花素大黄治疗组,/只、糖肾清低剂量治疗组只、糖肾清中剂量治疗组只及糖肾清高剂量治疗组只糖肾清为灯盏花素大黄配伍。另取只年龄、体重相匹配的正常雄性大鼠作为正常对照组。各治疗组按以上剂量每日上午灌胃给药,正中文摘要复方灯盏花素对实验性耱尿病肾病保护作用的研究常对照组和糖尿病对照组以等量的双蒸水灌胃。给药后处死大鼠,取血、尿和肾脏标本,测定血糖、血尿素氮、甘油三酯、胆固醇、血尿肌酐、内生肌酐清除率、尿白蛋白排泄率、肾指数、肾组积超氧化物歧化酶的活性及通过免疫组织化学的方法测定肾组织的表达光学显微镜下观察各组肾脏组织病理学改变并经图像分析测定平均肾小球面积和体积。研究结果后,糖尿病组大鼠的血糖、及肾指数较正常对照组明显升高,体重和肾组织活性明显降低光学显微镜下糖尿病大鼠肾切片可观察到肾小球面积明显增大,肾小球内系膜细胞明显增多,系膜区明显扩大,滤过间隙显著增宽,肾小管可见空泡变性,肾问质内有局灶状淋巴细胞浸润。图像分析后得到的和也明显高于正常对照组免疫组织化学结果显示糖尿病大鼠肾组织在肾小管上皮细胞、血管内皮细胞及系膜细胞胞浆处的着色较正常对照组明显浓集,图像分析后得到的积分光密度也明显升高。各药物治疗组大鼠的血糖、体重,尿量与糖尿病对照组相比无明显差异。除组的下降趋势与组相比未达显著性差异以外,、不同比例的联合用药及均能减少糖尿病大鼠,且降低幅度依次为。各药物治疗组中除组和组血的降低水平与组相比无显著性差异外,其它各治疗组均有降低,且降低幅度为。而对于,虽然与组的下降水平均未达显著性差异,但是联合用药组有较为明显的改善作用,且降低幅度。所有的药物组包括组与组、不同比例联合用药组及组其肾脏酶的活性与组相比均明显升高,且升高幅度为十。虽然组与组对糖尿病大鼠的降低水平未达显著性差异中文摘要复方灯盏诧素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究但均有降低的趋势,且不同比例联合用药组对肾小球的高滤过有较为明显的改善作用,顺序依次为。除组以外,各药物组血与组相比均有明显的下降,降低幅度。而对于血,各药物组与组相比均无显著性差异。包括、不同比例联合用药组及组在内,其肾指数较组均有所下降,降低幅度,组虽未达显著性水平,但也显示有降低趋势。光镜下各药物组大鼠肾组织系膜细胞的增多、系膜区的扩大、滤过间隙的增宽及肾小管空泡变性等病理改变较组有所减轻,图像分析后得到的和也显示而各药物组除组及组降低水平未达显著性差异以外,其余组、不同比例联合用药组和组、均较组明显降低,降低幅度十。各药物组肾组织的着色较组均有减淡,图像分析后得到的积分光密度也提示各药物治疗组的表达除组降低幅度未达显著性差异外,其余各组包括组、不同比例联合用药组及组较组均有明显下降,降低顺序依次为。研究结论糖尿病大鼠时肾脏出现明显的结构和功能改变。卡托普利能延缓糖尿病肾脏结构和功能损伤的进展,其机制可能与其提高组织的抗氧化能力、改善肾内的血流动力学及抑制的过度表达有关。灯盏花素和大黄对有不同程度的保护作用,可能是与两者能提高组织的抗氧化能力,纠正脂质代谢紊乱及抑制的过度表达有关。两药当中以灯盏花素的疗效较好。灯盏花素和大黄联合用药组对的保护作用大于各单用药组,而不同比例的合用药组中又以糖肾清高剂量组的疗效最佳。中文摘要复方灯盏花素对实验性糖屎病肾病保护作用的研究关键词糖尿病肾病,血管紧张素转化酶抑制剂,灯盏花素,大黄,转化生长因子英文摘要复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究印脏锄,孤巾,吼主,撕鲫廿批叫,蓼刚,埏,。,仃血,。乒廿油币,妒【,虹髓盯,眺,仃,眺,觚,非,英文摘要复方灯盏花素对实验性糖尿病肾瘸保护作用的研究蟾,啦,眦咖廿如仃【也嵋响,仃,甜,缸,【仃协砒皿仃,、砌,曲,皿仃器,、劬臼帆,衄龇,孤即廿血赶,锄印印廿,王璐复方灯盏仡素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究英文摘要,曲,削印舭柚“,蟾仃廿己,出,廿协,王,血,仃粤曲托,】,【血碍,础劬啪【,咖砒且印曲脆挥,英文摘要复方灯盏花索对实验性糖尿病肾病保护作用的研究培虢缸印锄也曲叩,缩略词表复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究缩略词表糖尿病糖尿病肾病肾素一血管紧张素一醛固酮系统血管紧张素血管紧张素转化酶抑制剂血管紧张素受体拮抗剂卡托普利灯盏花素大黄细胞外基质糖基化终产物蛋白激酶肾小球滤过率醛糖还原酶活性氧簇尿白蛋白排泄率转化生长因子链脲佐菌素美国糖尿病控制与合并症试验英国前瞻性糖尿病研究糖尿病适直血压控制试验一坎地沙坦和赖诺普利联合治疗微量白蛋白尿试验前言复方灯盏花豢对实验性糖尿病肾病保护作用的研究第一章前言随着经济的快速发展,人们生活水平的日益提高,生活方式的改变和入均寿命的不断延长,糖尿病的患病人数也在逐年增加。据统计目前全世界约有亿千万糖尿病患者,预计到年患病人数将增加一倍,且增加的患者大部分来源于低等和中等收入的国家,这对于任何国家包括发达国家都是一笔沉重的负担。自胰岛素应用以来,糖尿病,【患者死于急性并发症的人数已明显下降,目前慢性并发症已经成为糖尿病患者致死致残的主要原因,其中又以糖尿病肾病,最为突出。是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一,也是导致终末期肾病乃至透析治疗的首要原因。在型糖尿病患者当中,是其主要死因在型糖尿病,的严重性也仅次于大血管并发症。但是现今对于的确切发病机制尚不清楚,也无特异性的防治手段,因此,探讨的发病机制和防治措施已成为全世界医药界当前亟待解决的重大课题。糖尿病肾病的流行病学流行病学调查研究表明我国糖尿病的标化患病率为,也就是说目前我国的糖尿病患者超过万,并且糖尿病的发病率有逐年增加的趋势。,这些患者中大约三分之一将发展为。多见于型糖尿病,几乎的型糖尿病患者合并有,且的型糖尿病患者死于肾功能衰竭型糖尿病的发生率相对较低,约为,但由于型糖尿病患者基数大,故临床上型糖尿病合并的患者更为常见。在美国,已上升为的首位病因,约占,在欧洲占,在日本也高达,在我国约占总数的,而且在透析病人中患者的比例日渐增高”“。糖尿病肾病的发病机制日爵复方灯盏花素对实验性糖屎病肾病保护作用的研究糖尿病可合并多种肾脏并发症,主要有糖尿病性肾小球硬化症、肾小动脉硬化症和急性或慢性肾盂肾炎,这三种病变统称为。一般是指糖尿病性肾小球硬化症,为糖尿病重要的慢性微血管并发症之一。其基本病理改变早期表现为肾小球和肾小管肥大,肾小球高灌注、高压力和高滤过继而肾小球系膜区细胞外基质,增多,系膜区扩张,肾小球基底膜增厚晚期出现肾小球毛细血管闭塞,滤过率下降,肾小球硬化和肾间质的纤维化,最终导致肾功能衰竭。的发生和发展是多种因素综合作用的结果,虽然其确切的发病机制至今仍未阐明,但肾脏血流动力学异常、糖基化终产物,的生成、多元醇旁路的激活、蛋白激酶,的激活、氧化应激、多种细胞因子的激活以及遗传背景均参与了的发病过程“。其中又以的生成,多元醇旁路的激活,的激活及氧化应激这“四大通路”研究最多。肾脏血流动力学异常糖尿病患者早期即有肾血流动力学改变,表现为肾血流量、肾小球毛细血管静水压的增加和肾小球滤过率,的升高。已有资料表明,肾小球高灌注、高内压和高灌注是的始动因素之一,能诱发糖尿病性肾小球硬化“。借助微穿刺技术对多种不同类型动物模型的肾内血流动力学的研究结果进一步证实,肾小球滤过率增加的主要原因是由于肾内血管阻力,尤其是入球小动脉和出球小动脉阻力降低,使得单个肾单位血浆流量增加,由于与出球小动脉相比,入球小动脉的阻力下降更为明显,从而使肾小球滤过压增加,导致肾小球高滤过。肾血流动力学异常的形成是多因素综合作用的结果,一般认为这种高灌注和高滤过首先与高血糖有关,动物试验及临床研究均证实严格控制血糖可使糖尿病动物及糖尿病患者的下降,肾肥大减轻,微量白蛋白的排泄减少“。另外肾素一血管紧张素一醛固酮系统、前列腺素、一氧化氮、内皮素、心钠素、生长激素、胰高血糖素、胰岛素、转化生长因前言复方灯盏花秉对实验生糖尿病肾瘸保护作用的研究子,等多种因素均参与了高灌注、高滤过的发生“。目前认为肾小球血流动力学改变引起,主要有以下几种机制肾小球高滤过率及高内压可引起系膜基质扩张和肾小球基底膜的增厚,最终导致肾小球硬化“”血流动力学改变所致的机械力和剪切力可能引起内皮和上皮细胞损害,从而破坏正常的滤过屏障,蛋白质滤过增加肾小球毛细血管壁张力增高促使各种细胞因子合成和释放增多,从而导致肾小球硬化肾小球毛细血管压力增高可直接激活。多元醇旁路的激活多元醇通路由醛糖还原酶,和山梨醇脱氢酶,组成,是其限速酶。正常情况下多元醇通道相对是不活动的,在高血糖状态下由于己糖激酶呈饱和状态,过剩的葡萄糖不能通过正常途径氧化分解而激活了多元醇旁路。葡萄糖在作用下转变成山梨醇后者再在作用下转变成果糖。一方面由于山梨醇是一种极性很强的物质,不能自由透过细胞膜,从而在细胞内大量堆积,造成细胞内高渗状态,导致细胞肿胀破坏。另一方面引起细胞内肌醇减少,一磷酸肌醇合成受限,进而使。酶活性下降,导致细胞结构和功能异常。再者葡萄糖转化成山梨醇需要,而是合成还原型谷胱甘肽的重要底物,因此多元醇旁路的激活削弱了细胞抗氧化应激的能力。并且多元醇旁路中间产物如一本身即是的前体物质,所以多元醇旁路的激活也增加了的形成。晚期糖化终产物的生成高糖状态下蛋白质、核酸、脂质等大分子物质发生非酶性糖基化,先是形成碱基,再异构化生成产物,后者经脱水、分子重排最终形成不可逆的晚期糖基化终末产物。可能通过以下几种机制造成肾脏损害使肾小球基底膜成分交联增多。卜等研究认为肾小球日蔷复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究基底膜的形成可以引起结构改变,滤过膜负电荷减少、滤过孔径增大,导致的通透性增加。另外,交联使胶原不易受胶原酶降解,这也是胶原堆积和增厚的重要机制之一。使循环白蛋白交联、交联后的白蛋白更,易透过滤过膜,滤过的白蛋白堆积在系膜区,促进系膜细胞增殖及增多,导致肾小球硬化。另外,肾近曲小管重吸收白蛋白的同时促使肾小管细胞向肌成纤维细胞转化,从而导致肾小管肥大和间质纤维化“。与胞膜上特异的受体结合后,通过激活卜。促使细胞表达大量的炎性细胞因子,并诱使致硬化细胞因子的表达。,从而促进合成、抑制其分解,导致肾小球硬化。还可刺激脂质过氧化,使自由基生成增多,而脂质过氧化反过来又可促进的生成,从而形成恶性循环,共同促使的发生和发展。蛋白激酶的激活等”“研究发现,高血糖本身即是强大的激活剂,另外,高血糖引起二酯酰甘油,合成增加,导致细胞内升高,进而激活。属于丝氨酸一苏氨酸激酶家族,在血管收缩、血流动力学、细胞增殖等生理过程中发挥重要的调节功能。静息状态下几乎以无活性的形式存在于胞浆中,当有外界刺激时,移位到细胞膜而被激活。“。活化的再激活淞、及姒等信号通路,参与的发生和发展”。哺乳动物的家族至少由种亚基组成,与有关的主要是和。氧化应激近年来有证据显示,高血糖激活线粒体电子传递链从而导致活性氧自由基,的形成是发生过程中的早期事件呲,这个过程见卜“。由于血糖浓度升高,胞膜上的转运体一和一摄入过多的糖进入胞内,伴随糖酵解和三羧酸循环的增强及辅酶和。等供电子体合成的增多,更多的质子向线粒体内膜胞液面泵出造成线粒体内膜上呼吸链电化学梯度的升高,膜电位的升高使得电子的传递受阻于复合物,从而使复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究前言辅酶自由基中间产物的半衰期延长,最终导致转化生成晚一。高血糖导致线粒体内活性氧簇生成,而氧化应激的增强进一步激活了多元醇旁路、的生成、。、血管紧张素,、细胞因子等通路见卜“”,因此氧化应激是发生发展过程中的共用机制衄。嗡融俺,耕阳时已一只瀚脚鹤出醴,/、警囟蕊细胞因子和生长因子刖舌复方灯盏花崇对实验性糖尿病肾病保护作用的研究近年来有关细胞因子、生长因子在发病过程中的作用引起了广泛的关注。目前研究发现与发病有关的细胞、生长因子按其作用特点大致分为“参与肾小球血流动力学改变的细胞因子如胰岛素样生长因子和血小板源生长因子参与细胞肥大的如和一参与细胞外基质代谢的如和结缔组织生长因子参与细胞增殖的如血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子影响胰岛素信号传递的如肿瘤坏死因子和一参与细胞凋亡的如和一。上述细胞、生长因子在体内通过自分泌、旁分泌、内分泌途径,在血耱、氧化应激、血流动力学改变等因素调控下,相互影响、相互制约,构成了发病过程中复杂的细胞因子网络,其中又以为核心因子。一是超家族的一员,是由个氨基酸残基组成的同型二聚体。它是一种典型的多功能的细胞因子,主要通过自分泌和旁分泌发挥其调节功能,在细胞生长与分化、凋亡、细胞迁移、免疫细胞的功能、胞膜外基质的生成等正常生理过程中都起着非常重要的作用。人类主要表达种同功异构体,和,其中被认为是在过程中起主要作用的异构体。高血糖、均可诱使一表达增加。“,研究表明无论是在诱发的糖尿病大鼠的肾脏,还是在自发性糖尿病大鼠或自发性糖尿病小鼠的肾脏,的表达及其蛋白质含量均明显升高,同时伴肾脏肥大和细胞外基质增多。人体研究也发现时无论是肾小球还是肾小管间质部表达水平均升高,并且尿中的含量也较正常人明显升高。是一种致纤维化的细胞因子,它在中的作用主要是抑制细胞增生、促进细胞肥大及积聚。通过抑制细胞周期,从而使细胞内、蛋白质含量增加、细胞体积增大。而促进积聚主要表现在。刺激型胶原、纤连蛋白,和层粘连蛋白,等多种成分的合成抑制金属蛋白酶从而抑制基质的降解调节基质细胞整合素受体的表达,促进细胞与基质粘附及基质沉淀。在诱发的糖尿病大鼠模型中给予中和性抗体可明显抑制、胶原、的表达,改善肾肥大及积聚。“。因此,目前一已成为公认的一个新的治疗靶点。前占复方灯盏花素对实验性糖屎病肾病保护作用的研究遗传因素不论是型还是型糖尿病患者仅有一的病人最终发展为口,临床上一糖尿病患者无论血糖控制如何,患病多年可不发生,而的糖尿病患者在发病短期内,即便血糖控制良好,却发生。另外,的发生还呈家族聚集性,并且在不同种族间的发病率也存在着明显的差异,这些都提示遗传因素是发病过程一个重要的危险因素。目前研究显示包括皿管紧张素转化酶、血管紧张素原、一、载脂蛋白、一等基因在内的基因多态性现象与的发生发展有关“。糖尿病肾病的临床分期一般糖尿病病史年以上,合并高血压尤其是型及其他一些微血管病变如视网膜病变要考虑可能并发。最重要的诊断方法是检测患者尿微量白蛋白,但需要在纠正糖代谢紊乱及控制高血压之后检测,并努力排除其他肾脏疾病及尿路感染等因素的影响。目前临床上通用的是分期,根据肾损害的程度将分为期期肾小球高滤过期此期主要表现为增加,上升约一,同时肾脏体积增大。此期病理检查除发现肾小球肥大外,无其它器质性病变。如果及时纠正病人高血糖,上述变化可逆转。期无临床表现肾损害期此期可出现间断性微量白蛋白尿,运动等应激因素后可出现微量白蛋白尿/或/,休息后恢复正常。在此期内病人的仍较高或己恢复正常,血压多正常。此期病理检查可发现常需电镜检查确定肾小球早期病理改变,即肾小球基底膜轻度增厚和系膜区轻度扩张。期早期糖尿病肾病期持续性微量白蛋白尿的出现为此期的标志,即便病人未活动,尿微量白蛋自排泄率亦达“/或讯/水平,此期病人大致正常,血压常己开始升高。病理检查肾小球基底膜增刚茜复方灯盏花素对实验性糖屎病肾瘸保护作用的研究厚及系膜基质增宽较期更明显,小动脉壁出现玻璃样变。期临床糖尿病肾病期约有的微量白蛋白尿期病人在年发展至临床蛋白尿叫。此期/或/,表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高血压等。病人常进行性减低,血压明显丹高。病理检查肾小球病变更严重,部分肾小球已硬化,并伴随出现灶状肾小管萎缩及间质纤维化。期肾功能衰竭期从出现大量蛋白尿开始,如不治疗病人肌酐清除率以/的速度急剧下降,常在年内发展至。病理检查可见多数肾小球硬化、荒废,多灶性肾小管萎缩及间质纤维化。一旦发展到,五年生存率不容乐观,在德国为,澳大利亚为。糖尿病肾病的防治尚无特效治疗,其防治遵循糖尿病及慢性肾功能不全的一般原则,防重于治。对于糖耐量异常及患者严格控制血糖、饮食治疗结合适当的体育运动有助于预防的发生。“。一旦确诊为即采取综合治疗的措施,包括严格控制血糖、严格控制血压、给予和、限制饮食中蛋白量的摄入量、控制血脂等。当发展至时,则需进行透析或肾移植治疗。严格控制血糖年美国糖尿病控制与合并症试验,对例型糖尿病患者进行了近年的前瞻性研究,证实胰岛素强化治疗使患者的血糖及糖化血红蛋白接近正常水平能明显降低微血管并发症的发生,例如糖尿病眼病的发生率降低了,而蛋白尿的发生率降低了”。与此类似的年英国前瞻性糖尿病研究,对多例型糖尿病患者进行了长达年的观察,发现强化治疗严格控制血糖能有效降低各类微血管并发症的发生,其中对发展至蛋白尿危险性的降低为。因此控制血糖是防治基本而重要的措施之一,目前常用的前言复方灯盏花索对实验性糖尿病肾病保护作用的研究降糖药物为糖适平、二甲双胍和胰岛素,而糖化血红蛋白是反映血糖控制良好与否的指标。然而并不是所有血糖控制良好的病人都能免于发展为,在中严格控制血糖的病人发展为微量白蛋白,而在其发生率为,这些现象提示血糖以外的其它因素在发病过程可能起着重要的作用,而这些其它因素包括高血压、血脂异常、吸烟和遗传异质性等。严格控制血压有研究表明的型糖尿病新发病例合并有高血压“,高血压虽然不是的必然事件,但是它是患者发展为及促进恶化的重要危险因素,及早的治疗高血压不仅有利于阻止心血管事件的发生也有利于阻止及糖尿病眼病的发展,目前认为严格控制血压起着与严格控制血糖相同甚至更大的作用“。在糖尿,病适宜血压控制试验中,通过例血压正常但有微量白蛋白尿的型糖尿病患者年的前瞻性研究,发现严格血压控制较中等血压控制能明显降低期、糖尿病眼病及中风的发生率”,提示糖尿病病人的血压应该控制在低于正常的水平以取得最大的保护作用。世界卫生组织、美国糖尿病协会等各大机构均建议糖尿病患者的血压应控制在/“,合并有大量蛋白尿的患者如果能耐受,血压应控制在/“。目前对于患者,降压的一线药物为及,二线药物为拮抗药和噻嗪类利尿剂,并且大多数患者通常需要联合使用平均约个降血压药物才能达到目标血压值“。蛋白尿是的一个重要特征,也是进展和发生心血管事件的一个独立的危险因素“。相对于其它降压药物的优势在于它能降低患者的尿蛋白排泄、保护肾功能。对肾脏的保护作用在相对较低的剂量低于降压的剂量即可出现,所以目前认为其对的保护作用是独立于降血压之外的,这与在发前言复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究病过程中所起的重要作用有关。研究表明时肾局部的呈激活状态,参与了发病过程中包括血流动力学改变、肾肥大、系膜外基质的积聚、细胞因子的激活、活性氧簇的生成、足细胞的损伤、蛋白尿和间质炎症反应等在内的所有的病理生理过程“。通过抑制的生成从而阻止的进展。另外,血管紧张素转化酶是一种羟基肽酶,其底物除血管紧张素外尚有缓激肽、物质及神经肽等,因此在抑制生成之外,还能抑制缓激肽的降解,产生扩血管效应。与类似能降低尿蛋白,延缓的进展,且疗效呈剂量依赖性,与不同之处在于对从的阻断更为彻底。的形成除催化血管紧张素转化生成以外,糜蛋白酶等其它代谢途径均可生成,而在受体水平直接阻断的作用,无论何种来源、何种途径产生的均可被其抑制,因此与相比,更能有效地阻断的生物效应。与联合应用联合应用与能够发挥两者的各自优势,从而达到完全阻断和抑制缓激肽的降解,产生扩血管效应的双重疗效。坎地沙坦和赖诺普利联合治疗微量白蛋白尿临床试验,删对例型糖尿病合并高血压及微量白蛋白尿患者进行了年的观察,发现联合治疗组较单药治疗组更能有效的降低血压和尿白蛋白排泄率“,目前认为联合治疗适用于有严重蛋白尿和或难控制高血压的患者。限制蛋白质的摄入动物和临床实验研究均观察到高蛋白饮食能增加肾小球的灌注和压力,从而前言复方灯盏花索对实验性糖屎病肾病保护作用的研究加重所引起的血流动力学改变,相反低蛋白饮食能延缓的进展。根据患者肾功能损害程度不同,对蛋白质摄入量的限制也有所不同一般来说,糖尿病正常蛋白尿者饮食蛋白摄入量为/垤,早期患者为/,临床患者为/,对于肾功能衰竭、肌酐清除率/的患者,蛋白摄入量应控制在/以下。并且摄入蛋白质种类应尽量选择动物蛋白。对于有严重低蛋白血症及营养不良的患者,限制蛋白质摄入不必太严格。纠正胎代谢紊乱动物实验显示还原酶抑制剂,他汀类药物能减轻诱导的大鼠的蛋白尿,抑制肾组织的表达“而来自英国、日本和美国的一些小规模临床研究也提示他汀类药物不仅可蛆降低血脂,也可减少患者的尿蛋白、延缓的进展及阻止心血管事件的发生“。关于降血脂药物对的作用还需大规模的临床长期前瞻性研究加以证实,但控制血脂对于阻止心血管事件发生的作用是毋庸置疑的。戒烟来自和的研究均证实吸烟可以加速的进展,是型及型糖尿病肾脏病变的重要致病因素,研究还指出吸烟者较不吸烟者出现微量白蛋白尿的概率更大。“。吸烟还可引起血管收缩、血小板功能异常、凝血异常及血压升高,而这些因素反过来又可加速血管损伤。因此戒烟可以延缓的进展、减少心血管事件的发生。其它药物治疗的探索国外学者根据发病机制的四大通路,研制出多种特异性针对四大通路中某前言复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究一通路的药物,但大多尚处于动物试验、观察和试用阶段,主要包括以下几类抑制剂动物实验中给予抑制剂可以明显改善肾脏功能,减少尿蛋白,延缓的发展。在年代抑制剂曾被认为是糖尿病并发症研究中的一项重大进展,并在全球掀起了抑制剂治疗的热潮。但在随后的双盲、随机、对照研究中,特别是临床研究中都没有动物实验那样好的疗效,有的甚至得出否定的结论。已有证据表明基因的不同表达影响糖尿病慢性并发症的发生,在人类不同组织中蛋白及活性水平有异质性,并且的组织水平与特异的糖尿病的并发症相关。因此目前对的研究多集中在遗传多态性上。抑制剂氨基胍抑制剂氨基胍已广泛应用于动物实验,等用氨基胍治疗链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠,证实可减轻肾损伤、阻止蛋白尿的发生”。报道氨基胍可降低血水平,显著抑制肾脏昼、型胶原的表达,从而延缓的进展“。但由于其毒副作用过大,故未能应用于临床”。特异性的抑制剂“研究发现在诱导大鼠早期,特异性的抑制剂能使肾血流量和得以改善,尿白蛋白分泌率降低,提示对有保护作用。目前这类抑制剂已进入临床试验阶段。抗氧化剂多为一些非特异性抗氧化剂,如等。近年来有关。、硫胺素、硫辛前音复方灯盏花豢对实验性糖尿病肾病保护作用的研究酸等抗氧化剂在动物实验中报道较多。中医药在防治中的应用中药治疗已有数千年的历史,在中医学中既属消渴病,又属肾病。外台秘要引古今录验云“渴而饮水不能多,但腿肿,脚先瘦小,阴痿弱,数小便者,此为肾消病也”,即消渴病肾病。临床实践表明,无论是中药复方,还是单味中药提取物都在各期发挥着多靶点、多层次的治疗作用。目前认为对有治疗作用的中药主要有灯盏花素、大黄、黄芪、银杏叶、三七、刺五加、山茱萸、川芎嗪、水飞蓟宾、雷公藤、茶色素、桑枝提取物等,其中又以灯盏花素和大黄研究较多。灯盏花素灯盏花又名灯盏细辛,为菊科飞蓬属多年生草本植物,产于云南、广西等地。其主要活性成分为灯盏花素,包括灯盏花甲素和灯盏花乙素。据本草纲目记载“灯盏花性寒、微苦、甘温辛,具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛功效,故临床常用于治疗风湿痹痛、脑血栓、脑缺血和脑血管后遗症等疾病。自本实验室于年在报道灯盏花素对糖尿病大鼠血管内皮功能的损害有保护作用”,及在中国药理学通报报道灯盏花素可显著提高糖尿病大鼠肾脏的抗氧化能力和降低氧化应激以来,有关应用灯盏花素治疗的报道闩益增多。如吴永贵等”探讨灯盏花素对诱导的大鼠模型的影响时,发现灯盏花素能降低糖尿病大鼠的肾指数,减少尿白蛋白排泄率,抑制肾组织及的表达,提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性。林辉等”对比了灯盏花素与特异性的一抑制剂对糖尿病大鼠肾脏的保护作用,发现灯盏花素与类似能抑制肾组织的活性、降低从胞浆向胞膜转位。临床研究也显示灯盏花素能降低患者的血脂和血粘度、改善微循环和肾功能、减少尿蛋白的排出。这些研究均提示灯盏花素对具有前言复方灯盏花豢对实验性糖屎病肾蕊保护作甩的研究保护作用其机制可能与抑制四大通路中的激活与氧化应激、抑制的过度表达及调节血脂等作用有关。,。大黄二十世纪八十年代日本学者”首先开展中药大黄对糖尿病患者肾损害的药理作用研究,其后大黄及其活性成分对肾脏的保护作用越来越多地被人们所认识。大黄,又名将军、锦纹大黄、川军等,大黄的提取物可分为葸醌类、二苯乙烯苷类、色酮类、萘酚苷类、苯丁酮类以及鞣质等几大类。研究发现,对肾脏有保护作用的主要为蒽醌类中的大黄素和大黄酸。艾智华等报道经大黄酸治疗的糖尿病大鼠血尿素氮、肾指数、内生肌酐清除率、尿白蛋白排泄率、平均肾小球面积和体积及肾组织的含量均降低。戴春笋等进行了观察期长达一年的远期动物实验,发现大黄酸可以降低糖尿病大鼠尿蛋白排出量,减轻肾脏肥大,缩小肾小球面积及系膜区面积,降低肾小球及的高表达,并可改善糖尿病大鼠的血脂代谢异常。研究表明大黄是一种有效的抗氧化剂,如陈季武等“”用化学发光体系检验大黄清除多种活性氧的作用,结果显示大黄能清除、。和其他活性氧,抑制脂质过氧化。而日本学者”发现大黄抑制活性氧活性的浓度为几,换算成单位为/。因此目前认为大黄提取物治疗的机制主要是与抑制四大通路中氧化应激、作用于相关的细胞因子如,改善脂代谢紊乱等相关。本课题研究目的综上所述,糖尿病已成为二十一世纪威胁人类健康的主要疾病之一,据统计,目前全世界至少有亿糖尿病患者,预计到年患者的数目将达到目前的倍,且大部分来源于发展中国家。由于胰岛素的使用,槠尿病患者死于急性并发症的比例已经大大下降,各种慢性并发症,其中又以为首,已成为糖尿病患者致死致残的主要原因。然而目前西医针对的防治尚未有特异性切实有效的措施,并且新药研发多集中在发病四大通路的某一条通路。而中医因其多靶墨互堑墨垄壅翌壅墅丝塑垦堕堕堕堡竺堡旦竺堑塞塑室点、整体治疗、辨证施治的优势可弥补西医的不足。众多的研究证实,灯盏花素能抑制糖尿病慢性合并症发病四大通路中的激活及氧化应激,而大黄具有抗氧化的作用,它们各自治疗的报道虽不少,但尚未见联合应用制成小处方的中药制剂来治疗的先例。本课题拟通过不同比例的灯盏花素与大黄进行增效减毒、科学配伍,观察其对诱导的糖尿病大鼠动物模型肾脏的保护作用并探讨其可能的机制,为的防治提供一种安全、有效且价廉的中药提取物,产生巨大的经济和社会效黼。材料与方法复方灯盏花素对实验性糖屎病肾瘸保护作用的研究第二章材料与方法实验动物正常雄性大鼠,体重一,由中山大学北校区实验动物中心提供。实验药物卡托普利儿由江苏常州制药厂提供,产品批号。灯盏花素购自云南玉溪万方天然药物有限公司,产品批号。大黄由上海医药工业研究所提供。糖肾清颗粒由上海医药工业研究所提供。主要试剂链脲佐菌素/瓶,购自公司。甘油三酯测定试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。总胆固醇测定试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。尿素氮试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。肌酐试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。大鼠尿白蛋白放免试剂盒,/,批内,批间,购自北京福瑞生物工程公司。转化生长因子一抗兔抗鼠多抗,购自公司。材料与方法复方灯盏花素对实验性糖尿病肾瘸保护作用的研究,/,/凯“购自公司。主要实验仪器堡灵曼血糖仪及血糖试纸,皿,。,。核酸蛋白分析仪,。组织匀浆机高速冷冻离心机,。恒温孵育箱,。,放射免疫计数器一型放射免疫计数器,众成机电技术公司。石蜡切片机切片机,。硒微波炉小康星一,广东美的电器股份有限公司。普通光学显微镜带摄像系统,。摄像仪,。全自动医学图像分析系统一,成都泰盟科技有限公司。实验方法动物模型的建立、聃大鼠禁食小时后,一次性左下腹腔内注射由枸橼酸钠溶液几,高压灭菌配制的舭诱导糖尿病模型,正常对照组给予等量的溶剂。周后尾静脉采血,血糖,衄/确立为模型成功。整个实验期间不限饮食,不给予胰岛素等降糖药物。,实验分组材料与方法复方灯盏花素对实验性糖尿病肾病保护作用的研究随机分组正常对照组,正常大鼠,每天灌胃同体积的生理盐水。糖尿病对照组,糖尿病大鼠,每天灌胃同体积的生理盐水。卡托普利治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃卡托普利/。大黄治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃大黄/吨。灯盏花素治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃灯盏花素/。灯盏花素大黄治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃灯盏花素大黄/。灯盏花素大黄治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃灯盏花素大黄/。糖肾清低剂量治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃糖肾清/妇。糖肾清中剂量治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃糖肾清/。糖肾清高剂量治疗组,糖尿病大鼠,每天灌胃糖肾清/。糖肾清为灯盏花素大黄的配伍。另外本实验室前期实验证实灯盏花素/对糖尿病眼病等慢性并发症有较好的疗效,因此,本实验灯盏花素与大黄及配伍组中灯盏花素的剂量均为/。从证实模型建立成功当天起开始灌胃,每只大鼠每次灌胃体积约为札,每周称体重一次,根据体重变化调整给药量,共观察周。实验标本采集尿液标本给药后,将各组大鼠放入代谢笼中留取尿液,计量后取,转/,离心,取上清保存于一,直至检测尿白蛋白和肌酐。每只大鼠共收集天的尿液,取平均值为该鼠的尿量。血液标本材料与方法复方灯盏花素对实验性糖尿疬肾痫保护作用的研究腹腔注射后,取大鼠尾尖血,血糖仪测血糖。给药后称重,各大鼠断颈取血,血标本静置后,转/,离心,取上清保存于一,直至检测血尿素氮、肌酐、甘油三酯和胆固醇。肾组织的处理大鼠断颈放血处死后,迅速剖腹取肾,剥离包膜和结缔组织,滤纸吸净残余血液后,称双侧肾重。取左肾中段甲醛固定,用于制作染色切片和免疫组化白片取右肾一置于冻存管,液氮迅速冷却后保存于一,直至检测肾组织。观察指标及测定方法血尿素氮的测定法根据试剂盒说明书操作,最后用核酸蛋白分析仪光径,波长处测定各管吸光度值。岫/测定管吸光度/标准管吸光度标准品浓度样本稀释倍数血肌酐、尿肌酐的测定及内生肌酐清除率的计算除蛋白法根据试剂盒说明书操作,最后用核酸蛋白分析仅光径,波长处测定各管吸光度值。/测定管吸光度一空白管吸光度/标准管吸光度一空白管吸光度标准管浓度材料与方法复方灯盏花素对实验性糖屎病肾瘸保护作用的研究/测定管吸光度一空白管吸光度/标准管吸光度一空白管吸光度标准管浓度/尿量/血甘油三酯的测定一法根据试剂盒说明书操作,最后用核酸蛋白分析仪光径,波长处测定各管吸光度值。几测定管吸光度/标准管吸光度血总胆固醇的测定法根据试剂盒说明书操作,最后用核酸蛋白分析仪光径,波长处测定各管吸光度值。唧/测定管吸光度/标准管吸光度肾组织的测定制备组织匀浆取肾组织在冷生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入的圆底管内,加入/预冷的匀浆介质生理盐水,冰水浴中用眼科剪尽快剪碎组织块后,用内切式组织匀浆机上下研磨制成组织匀浆转/,匀浆时间秒/次,间隙秒,连续次,在冰水浴中进行,将制备好的匀浆用低温低速离心机转/离心,取上清用匀浆介质稀释倍,即为组织匀浆。黄嘌呤氧化酶法根据试剂盒说明书操作,组织取样量为组织匀浆,最后用核酸蛋白分析仪光径,波长处测定各管吸光度值。蛋白定量采用考马斯亮兰法。活力/对照管吸光度一测定管吸光度/对照管吸材料与方法复方灯盏花素对实验性糖尿痫肾病保护作用的研究光度反应液总体积/取样量组织中蛋白含量/尿白蛋白的测定实验原理采用竞争放射免疫分析法,其基本原理是竞争抑制反应。标准品、样本中的与”竞争有限的特异性抗体抗体,当样本或标准品中的浓度高时,剩余的特异性抗体的结合位就少,从而与特异性抗体结合的”就少,反之结合就多。利用免疫分离剂分离出抗原一抗体复合物,并测定复合物中的放射性计数。”的结合量与样本或标准品中的的浓度呈负相函数关系,据此得到标准曲线,通过数据处理求出样本中的的含量。具体反应式如下有限量的复合物样本或抗体标准品一定量的标记”标记的复合物操作步骤全部试剂及样本室温平衡后使用按下表加样材料与方法复方灯盏花素对实验性糖屎病肾瘸保护作用的研究一单位。管管别管。标准管样本管缓冲液标准品样品”抗体充分混匀,加盖,孵育。各管均加入分离剂充分混匀后,室温静置,转/离心,吸弃上清液。测定各管沉淀的放射性计数。数据处理计算各管的百分结合率以。管的数为,各标准管数为,求各管的百分结合率。/管一管/管管线性回归用一回归,求出、值。一/绘图法用各标准点计算的结果,在一坐标纸上绘制标准曲线图,未知样品的浓度可根据”/的百分结合