DB21T 1749.3-2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程

案号： 辽 宁 省 地 方 标 准 2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程 2009布 2009施 辽宁省质量技术监督局 发布 2009 I 前 言 本标准附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E 为规范性附录。 本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省植物保护站。 本标准主要起草人： 蔡 明、宋雅坤、吴元华、李明福、江 冬、李 眷、李维根。 2009 1 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程 1 范围 本标准规定了 黄瓜绿斑驳花叶病毒 （ 的检验检测与鉴定方法。 本标准适用于全省各地开展黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验检测工作 。 2 术语和定义 下列 术语和定义适用于本标准。 检验 植物 、植物产品或其他限定物进行官方的直观检查以确定是否存在有害生物和 /或是否符合植物检疫法规。 检测 确定是否存在有害生物或为鉴定有害生物而进行的除肉眼检查以外的官方检查 。 鉴定 可疑的有害生物是否与已知物种同一的鉴别过程 。 发生 方报道在一个地区存在着土生或传入的有害生物 ，和 /或官方未报道在一个地区存在的有害生物已经被根除。 3 原理 黄瓜绿斑驳花叶病毒 属烟草花叶病毒属。 其病原形态特征见附录 A，其寄主范围、地理分布、生物学特性、危害症状和传播途径见附录 B，其血清学检测技术，应用双抗体夹心酶联免疫吸附法技术（ 定和分子生物学（ 定，具体检测方法见附录 C、附录 D。 4 材料、仪器、 用具及药品 料 葫芦科作物种子 、叶片和果实。 器、用具 电子显微镜 、台式离心机、分光光度计、 箱、酶联板、酶联读数仪、微量加样 器、洗瓶、载玻片、玻棒、研钵、微量离心管、培养皿、打孔器、滴管、吸管、量筒、三角瓶、水浴锅、毛细管、针头、电泳仪、水平电泳槽、胶手套、剪刀 、镊子、自封袋、油性笔、标签、记录本等。 品 专化性抗体免疫球蛋白 1度约为 1mg/酶标记羊抗兔抗体球蛋白 1售 )、碳酸钠 (无水 )、碳酸氢钠、叠氮化钠、磷酸氢二钠 (无水 )、磷酸二氢钾 (无水 )、氯化钠、氯化钾、 蛋清粉、聚乙烯吡咯烷酮、亚硫酸钠 (无水 )、牛血清白蛋白、二乙醇胺、氯化镁等。 2009 2 5 现场检验鉴定 子检查 在 11月翌年 2月份对市场销售的葫芦科作物种子和砧木种子进行扦样，每份样品取 100粒，送指定的有关部门进行检测。重点检查用做砧木的种子。 间调查 3月 10月份在黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生期，选择有代表性地块，检查叶片、果梗、果实，看叶片上是否出现黄绿相间斑驳、隆起、皱缩、蕨叶，果梗是否有褐色条斑，果实表面是否有斑驳、凸起，果实内部是否有空洞、黄丝、果肉暗红倒瓤等。 状检验 从植株上摘取病叶或果实，与附录 合附录 在调查现场将病叶取下，用快速诊断试纸条或诊断试剂盒（附录 E）进行初步诊断。 害发生分级标准 (以株为单位 ) 0级 ： 无任何症状； 1级 ： 心叶明脉，轻微花叶 ，发病面积占整个植株面积的 5%以下； 3级 ： 心叶及少数叶片花叶，发病面积占整个植株面积的 6 15%； 5级 ： 多数叶片花叶，少数叶片皱缩、畸形，植株轻微矮化，发病面积占整个植株面积的 16%30%； 7级 ： 多数叶片严重花叶，多数叶片皱缩、畸形，植株矮化，或叶柄有褐色坏死斑点，发病面积占整个植株面积的 31% 50%； 9级 ： 严重发病，叶片严重畸形，植株严重矮化，茎部有褐色条斑，发病面积占整个植株面积的 51%。以上。 情指数 按下式 计算。 100)( IN （ 1） 式中： 病情指数； n 各级病株数； N 该病级数； i 调查总株数； I 最高级数。 6 实验室检测鉴定 经现场检验检测，不能确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒的，取样带回实验室进行检测鉴定。 样方法 在发病植株上，随机选取发病叶片或果实（其数量以满足检测鉴定所需 为限），装入聚乙烯塑料袋中密封，贴好标签带回。标签应注明采集时间、地点、采集人等信息。对所采集的样本，应放入低温（ 4 ）密闭保存，要尽早进行鉴定。 毒鉴定 将所采集的样本进行血清学检测技术 （ 分子生物学技术（ 定，将检测结果与附录合附录 定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。 2009 3 7 标本保存 配有田间调查的植株、叶片、花、果实等资料，症状照片 ;当地专家的初步鉴定或识别结果。 品采集应以幼嫩叶片为主，特殊材料可以根据具 体情况灵活掌握，样品数量不少于 200g/份，每个标样 2份，提倡冻干样品（冷冻样品），送指定的专家鉴定。 地设法保存活体样品，以备应急使用。 合压制的叶片标本，应随采随压于标本夹中。 载寄主名称、发病情况、环境条件、采集地点、采集日期、采集人姓名等。 2009 4 附 录 A （资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒分类命名和病原特征 类和命名 名 类地位 烟草花叶病毒属 (毒异名 , 原特征 毒粒子 直棒状病毒，长 300 15沉淀系数 185S。等电点 80 酸 核酸含量 5，单链 子量 2106。 G:A:C:U= 蛋白含量 95，分子量 17261。氨基酸 160，其组成为 毒株系 根据不同分离物的血清学反应及其对 苋色藜和 蔓陀罗的症状反应，将其分为以下株系。 主要有 英国和欧洲报道的 典型株系（ 1935） ，日本报道的黄瓜株系（ 、西瓜株系（ 和 系 （ ，以及 印度 C 株系 (et 1975)。 2009 5 附录 B (资料性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒的寄主范围、地理分布、生物学特性、为害症状、传播途径及鉴别寄主 主范围 然寄主 西瓜、南瓜、甜瓜、黄瓜、葫芦、西葫芦、瓠瓜。 主范围 苋色藜、 蔓陀罗、 甜瓜、笋瓜、西葫芦、葫芦、丝瓜、烟草 。 理分布 目前， 世界已广泛分布，欧洲的英国、爱尔 兰、德国、荷兰、丹麦、俄罗斯、希腊、奥地利、捷克、斯洛伐克、芬兰、南斯拉夫、罗马尼亚、摩尔多瓦、波兰、乌克兰、拉托维亚、保加利亚、捷克、匈牙利、西班牙、瑞典；南美洲的巴西；亚洲的日本 ( 山、德岛、北海道、千叶 )、印度 (韩国、巴基斯坦 (西北部边境省份 )、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、朝鲜及 我国的辽宁、河北、山东、广东、湖北等省发生。 物学特性 死温度 黄瓜绿斑驳花叶病毒的致死温度为 90 100 释限 点 黄瓜绿斑驳花叶病毒的稀释限点 为 10 10-7 外存活期 体外存活期较长， 达 119d 以上 。 在 0 可保持数年， 20 病毒仍能存活 。 病毒在种子内可存活240d 540d， 病残体 在土壤内 深埋 420d，病毒仍有侵染活性 。 毒 粒体形态 电镜 观察 病毒粒体为棒状，长约 300宽 15 害症状 瓜染病症状 幼叶出现淡黄色花叶，其后出现斑驳、花叶、叶脉绿带状、浓绿凹凸斑等，随叶片老化症状减轻。有时也呈叶脉绿带状。果实表面浓绿圆斑，果蒂处有时坏 死，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞，并且呈丝状纤维化， 腐烂变味，不能食用。 瓜染病症状 感病后茎端新叶出现黄斑，但随新叶老化症状减轻。 成株侧枝叶出现不整形或星状黄花叶，生育后期顶部叶片有时再现大型黄色轮斑。果实有两类症状，一种在 果实表面出现 绿色斑。另一种在绿色部的中心出现灰白色部分。 瓜染病症状 感病初期 新叶出现黄色小斑点 ，以后黄色部分扩展成花叶，并发生浓绿瘤状突起，出现叶脉绿带。发病轻时 果实只 出现 淡黄色圆形小斑点， 严重时 出现浓绿色瘤状突起变成畸形 。 播途径 播方法 多种传播方式 ： 括 植物间接触、农事操作、汁液 ）； 2009 6 传毒（如 菟丝子 、 黄瓜叶甲 ）； 啮齿动物的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的牛粪 ）。 其中带毒种子是远距离传播主要途径。接触性传染是近距离传播主要途径。 染循环 该病毒在种子、病株残体 、土壤 中均可越冬，成为第二年的初侵染来源。带毒种子是主要 初 侵染源。在田间， 很容易地通过病株的汁液接触 传播， 人工 嫁接和授粉等方式 易再 传染 。 因此，田间农事操作如 整枝、上架、摘心、授粉、嫁接、摘果均可 导致该病毒的再次传播。 行与环境 发病受温度影响，在 16 时 侵染至 发病 需 2 3周， 显 病 较 轻 ； 在 28 35 下接种 1周即可发病，症 状 重。 有株系都是极端稳定的，其致死温度 90 100 ，稀释限点10 10温下病毒侵染力可保持数月，在 0 可保持数年， 20 病毒仍能存活，一旦条件适宜还能继续传播蔓延。田间一旦发病，如未进行特殊的杀灭处理，病株残体中的病毒可存活多 年，即便将病根埋在土壤内 365毒仍保持侵染能力。 别寄主 瓜 新叶出现黄色小斑点，后呈花叶并带有浓绿色突起，叶脉间褪色呈叶脉绿带状。 瓜 茎端幼叶出现淡黄色花叶，其后出现浓绿凸凹斑，随叶片老化症状减轻。果实表面浓绿圆斑，中央有坏死点，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞。 瓜 新叶出现黄斑，但随叶片老化呈叶脉绿带状。 瓜 叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化呈叶脉绿带状。 芦 幼叶出现淡黄色花叶， 其后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻。 色藜 经西瓜株系、 系和印度 C 株系侵染后出现细小局部坏死斑，而欧洲黄瓜株系不出现这种症状；无系统侵染。 陀 罗 系和日本的黄瓜株系在接种后 7d 产生能扩散的局部褪绿斑；无系统侵染。 2009 7 附录 C (规范性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ 准 器和用具 器设备 离心机、 电子天平 （ 1/10 000g） 、 酶标仪 等。 具 可调移液器 （ 20L 200L、 200L 1000L）及相关吸 头、 研钵、离心管（ 10量筒、烧杯 等 。 剂 被缓冲液 无水碳酸钠 碳酸氢钠 叠氮化钠 蒸馏水 定容至 1000整 4贮存。 洗涤缓冲液（ 磷酸氢二钠（无水） 磷酸氢二钠（十二水） 磷酸二氢钾（无水 ） 氯化钠 化钾 吐温 馏 水定容至 1000整 温贮存。 取缓冲液 鸡蛋清粉 分子量 2400） 无水亚硫酸钠 叠氮化钠 吐温 解于 10001X ，调整 4 贮存。 标抗体缓冲液 牛血清蛋白 子量 2400） 叠氮化钠 溶解于 10001X 整 4 贮存。 物缓冲液 二乙醇胺 氯化镁 叠氮化钠 蒸馏水 定容至 800 整 4 贮存。 样方法 子 取 若干 粒种子，去皮，加入样品提取缓冲液（ W/V=1： 8）研磨匀浆，离心后 4 保存待用。 片 取叶片加入提取缓冲液 （ W/V=1： 8）研磨匀浆。离心后 4 保存待用。 被 将 包被抗体按 照试剂盒指定稀释比例用包被抗体缓冲液稀释，混匀 ，加入酶联板中 ，每孔内加入 100 L， 放入保湿盒内， 4 冰箱 过夜。 涤 孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，用 涤液冲洗 3 次 4 次，每次 15s，然后将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。 2009 8 入抗原（待测样品） 在酶联板中加入抗原 (待测样品 )，同时加入 阳性指控物和空白对照（即样品提取缓冲液），阳性指控物、空白对照和待测样品每孔内加入 100 L，待测样品重复 3 次，恒温箱中或室温（ 2025 ）孵育2 h。 涤 按本规程 行。 入酶标抗体 将 酶标 抗体按 照试剂盒指定稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释，混匀 ，加入 酶联板中 ，混合均匀，于每个反应孔中加入 100L， 放入保湿盒内， 室温（ 2025 ）孵育 2 h。 涤 按本规程 行。 入底物试剂 孵育结束前的 15 备 物溶液，加入 色剂，混合均匀，加入酶联板，每孔 100 L。放入保湿盒内， 室温（ 20 25 ）避光 30 60 止反应 于每孔中加入 50 L 终止液，终止反应。 定 用酶标仪在 405 长下测量结果，读取各孔溶液的光密度值（ ）。 果评定 根据试剂 盒提供的方法和标准 。在阳性对照光密度值符合试剂盒设定值的前提下， 以微孔中 阴性 对照的 2 倍为标准，大于这个数值的样品为阳性结果，小于这个数值为阴性结果 。 另外各参照孔（包括底物孔、缓冲液孔、阴性对照、阳性对照）测定值要符合试剂盒设定的目标值；重复样品孔的光密度值一致。 品保存 对于检测结果显示为阳性的样品 ，必须对样品进行保存。 种子样品 应保存在 4 冰箱内，叶片和果实样品应保存在 20 冰箱内。 果记录与资料保存 完整的实验记录包括 ：样品的来源、种类、接收时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经 手人和实验人员的签字。 2009 9 附录 D (规范性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒 增聚合酶链式反应测定 (准 器和用具 器设备 泳仪、 凝胶成像分析仪 、 冷冻离心机、 电子天平 （ 1/10 000g） 、 、水浴锅、 振荡器等。 具 可调移液器 （ 0L 20L、 20L 200L、 200L 1000L）及相关吸 头、 、 研钵、离心管（ 10 0.2 量筒、烧杯、镊子 等 . 试剂 。 其他试剂：液氮、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭。 检疫程序 器皿前处理 为防止 皿在 试 验前都要 用 V： V=1： 1000） 进行处理。将研钵 、 枪头 、离心管等放于 7 ，浸泡 24 h，取出后 121 灭菌 30烘干备用。 总 提取 取 显症 的叶片液态氮 中充分 研磨， 转入 1.5 离心管中 ，加入 1 剂，室温下静置5 加入 200 5 s，室温下放置 5 12000 r/4 离心 15 移上清于一个新离心管中，加 600 0 12000 r/4 离心 15 掉上清液，在沉淀物中加 1 5%的乙醇清洗 1次，吸掉上清后室温干燥 35 入 30 L 应体系 引物序列 ( 上游引物 （ ） ： 5 下游引物 （ ） ： 5 验步骤 成 按下列组分制备 0L， 反应以加入 不含 反应 条件为 42 1 h； 99 5 5 5 反应体系见 表 增 在冰 浴 上依次将下列组分加入 ， 反应采用 50 L 体系 。反应条件为： 94 预变性 3 4 变性 30 s， 53 退火 45s， 72 延伸 1 35 个循环； 72 延伸 10 应 体系见 表 增产物凝胶电泳检测 取 5 L 扩增产物用 6解，点样。电泳检测，用溴化乙锭（ 液进行染色 30 外成 相系统（ 观察结果并摄像。 2009 10 表 应体系 表 应体系 结果评定 观察电泳结果 ， 00断样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒，否则为阴性。 样品保存 对于检测结果显示为阳性的样品，必须对样品进行保存 备查 。 种子样品 应保存在 4冰箱内，叶片和果实样品应保存在 箱内。 果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、 种类、接收时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。 反应组成 体积（ L） （ 10M） 10 各 10 1 40 U/L） 0 反应组成 体积（ L） 50 （ 10M） T 产物（ 10 0 2009 11 附录 E (规范性附录 ) 黄瓜绿斑驳花叶病毒 快速诊断试纸条或检测盒 测定标准 测样品处理 植物样品在检测前需经研磨，并用缓冲液稀释。植物叶片样品