临床微生物样本采集规范

临床微生物样本采集规范,2014-1-15,成功治疗感染症的决定因素,准确、快速病原学诊断医师判读病原菌培养结果选择适当治疗方法,准确、快速病原学诊断的决定因素,二大因素,临床医务人员提高送检意识标本采集运送储存,微生物室人员标本接收筛选处理分离鉴定,临床医生最不能接受的问题:阳性率低,“正确的微生物学检验始自正确的标本采取。临床医师、护师及检验技师都必须通晓其要领。”,著名的临床微生物检验专著Manual of Clinical Microbiology 的主编Patrick Murray,合格标本的结果才能引导（而非误导）做出正确的临床决定,我们应该追求：“准确的病原学诊断”“针对性病原学治疗” 正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！,病原学诊断的关键问题,减少污染鉴别污染和定植 提高阳性率临床及时有效治疗治疗感染而非污染治疗感染而非定植降低患者死亡率,标准化的流程,病原学治疗,微生物样本采样基本原则,1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.采样后立即送检，甚至床旁接种尤其是厌氧培养5.棉拭子标本宜用运送培养基6.混有正常菌群污染标本，不可置肉汤培养7.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂。8.送检标本应注明来源和检验目的,临床微生物标本的分类,带菌体液 无菌体液 痰 血液 咽拭子 脑脊液 尿液 关节腔积液 粪便 胸腹水 其他类别 其他类别,一、血培养操作规范,血培养主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以下菌应视为非病原菌(除非1次血培养分离出)：芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌,从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集10ml,#1,35C 空气中孵育5天每天检查浊度并翻转培养瓶,#2,#3,18小时后传进行次代培养当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养,革兰阳性球菌接种血平皿奥普托欣试验,革兰阴性杆菌接种血平皿和麦康凯平皿,革兰阴性双球菌或球杆菌接种巧克力平皿和血平皿,CO2中孵育72h,#5,#4,将重要的革兰染色结果尽快通知临床医生,对重要病原菌进行鉴定和药敏试验,#6,例如：肺炎克雷伯菌,例如：肺炎链球菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,血培养的临床意义,血培养查病原菌对诊断以下疾病很重要 -菌血症，真菌血症 -感染性心内膜炎 -临床不明原因感染 -假体植入后感染（人工关节，人工瓣膜） -导管相关性菌血症 -化脓性关节炎 -肺炎血培养是诊断败血症最有价值的手段,临床常见的采血指征,发热（38C）或低温（36C） 寒战 白细胞增多（计数大于10，000109/L，特别有“核左移” 未成熟的或杆状核的白细胞） 粒细胞减少（成熟的多核白细胞2种菌生长，报告“混合菌群”,#5,注意:,革兰阴性杆菌在血平皿和麦 康凯平皿上均生长良好革兰阳性球菌仅在血平皿上生长良好,GNR,#6,75,000 cfu/ml,50,000 cfu/ml,100,000 cfu/ml, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,GPC,尿道感染,每年850万例尿路感染, 90%为女性1/2.5个妇女在一生中会得UTI下行性感染：血流肾脏膀胱（金黄色葡萄球菌，酵母菌，结核分枝杆菌）上行性感染：尿道膀胱肾盂 血流,尿液培养标本送检指征,1 有典型的尿路感染症状；尿频，尿急，尿痛2 肉眼脓尿或血尿；3 尿道口有脓性分泌物；4 不明原因的发热，无其他局部症状；5 留置导尿管的病人出现发热；6 尿常规异常：白细胞，细菌计数，亚硝酸盐。,您知道吗？,正常人尿液是无菌的，而尿液细菌培养最大的问题是杂菌污染。正常人外尿道有大肠杆菌、葡萄球菌等存在。而这些细菌又是尿路感染中常见的病原菌。要作好尿液细菌学检查，首先应注意标本收集问题。,您知道吗？,尿液经尿道排出时会受到尿道内正常菌群的污染,但定量培养时计数不会超过103 CFU /m l, 泌尿系感染时定量培养在104 105 CFU /m l 。由于绝大多数的泌尿系感染是由肠杆菌科细菌引起,而此类细菌的硝酸盐还原实验为阳性,故可参考尿常规检查中的硝酸盐还原实验来推断是否有细菌感染。,尿培养样本采集方法（1）,标本采集应力争在未使用抗生素之前注意避免消毒剂污染标本 1 清洁中段尿中段尿（晨尿最佳）约10 20ml直接排入专用的无菌容器中，立即送检，2h内接种。2 耻骨上膀胱穿刺：评估膀胱内细菌感染的“金标准”方法。3 直接导尿：可减少污染，准确反映膀胱感染情况。,尿培养样本采集方法（2）,4 留置导尿管收集尿液：穿刺导尿管吸取尿液，不能从收集袋中采集尿液。长期留置导尿患者，应在更换新尿管时留取尿标本。5 集尿法：尿查抗酸杆菌时，留24小时尿液盛于洁净容器内，取其沉渣10mL送检。,泌尿标本采集的规范 （1）,1、标本采集后应立即送检，否则可暂存于4冰箱。 2、采集时间：使用抗菌药物前采集。应采集早晨第一次的尿。3、标本管不应含防腐剂和消毒剂。,泌尿标本采集的规范（2）,4、采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器，然后用清水冲洗。5、长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。6、 做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。,特别注意（1）,尿液通常是无菌的或一过性有少量微生物，但是尿道内或尿道周围皮肤的菌群会污染尿液标本，从而可能导致错误的培养结果。诊断症状明显的病人（如尿急、尿频、尿痛），一份标本就已足够，治疗48 72小时后再采集第二份标本。对于症状不明显的病人，需采集2 3份标本。怀疑肾结核时，应连续3天采集晨尿。,特别注意（2）,多次收集或24小时尿不能用作培养。申请单上必须注明病人症状是否明显，这对于定量培养分析非常重要，尤其只有少量尿液标本。室温都有利于病原菌和污染菌生长繁殖，因此若30min内不能及时培养尿液则必须冷藏，但也不能超过24小时。,特别注意（3）,多数药物从尿道排泄,所以标本采集应力争在未使用抗生素之前或停用抗菌药5d之后留取尿液标本;尿液在膀胱内应停留6 8h以上，使细菌有足够的时间繁殖,故应尽量采集早晨第一次的尿,同时注意避免消毒剂污染标本。,三、下呼吸道分泌物（痰培养）标本采取规范,肺部感染病原学诊断有哪些项目？,显微镜检查 -革兰染色 -湿片检查 -分枝杆菌检查 -肺孢子菌检查培养 -细菌与真菌，普通菌，厌氧菌，结核菌，真菌 -定量/半定量培养,免疫学方法 -抗原，尿可溶性抗原，GM，隐球菌 -抗体：肺吸虫组织病理学 -结核与其它分枝杆菌 -真菌（曲霉，隐球菌）分子生物学：核酸检测,痰标本主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌,病人需用水清洁口腔，深咳肺部痰，不要唾液,#1,进行革兰染色以评价标本是否适于接种。向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果,#2,#3,好：很少扁平上皮细胞,奥普托欣纸片,CO2中孵育48小时,#4,接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿,#5,拒绝：大量 扁平上皮细胞,肺炎克雷伯菌,对重要病原菌进行鉴定&药敏试验,金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,胆汁溶菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,奥普托欣,流感嗜血杆菌,下呼吸道标本标本送检指征,1 咳嗽、咳痰：痰液可为脓性、血性、铁锈色或红棕色胶胨样痰。2 咯血：肺结核病人常痰中带血。3 呼吸困难4 发热5 胸痛：当炎症病变累及壁层胸膜时，会发生胸痛。肺部感染的患者有25 50可能发生菌血症，应同时作血培养。,社区获得性肺炎临床路径（2009年版）,1.必需检查项目：（1）血常规、尿常规、大便常规；（2）肝肾功能、血糖、电解质、血沉、C反应蛋白（CRP）、感染性疾病筛查；（3）病原学检查及药敏；（4）胸部正侧位片、心电图。2.根据患者情况进行：血培养、血气分析、胸部CT、D-二聚体、血氧饱和度、B超、有创性检查等。,病原体种类繁多而复杂,使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌（包括军团菌、厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括曲霉，隐球菌、肺孢子菌）病毒支原体、衣原体与立克次体原虫寄生虫,咳痰途经口咽部,唾液中口咽部定植菌的浓度可达108 109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,不可避免地受到污染,我国痰细菌培养现状,厌养菌检出率极低结果重复性差报告速度慢感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差距,咳痰标本的采集,标本采集方法医师或护士直视下采集标本病人先漱口，去除表面的菌群教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液临床上约半数咳痰标本不合格！,关于咳痰标本,在抗生素应用前采集痰标本;标本采集后1 2h内必须立即进行实验室处理；咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口;深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导;无痰可用3 5NaCl 5ml雾吸约5min导痰；也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰；,咳痰标本不合格，退检吗？,如果低倍视野下鳞状上皮细胞大于25个，白细胞小于10个，应不做或仅在特殊要求时做培养。如做培养，报告中注明“镜检结果表明标本口咽分泌物污染明显”。,下呼吸道标本采集方法（1）,1 自然咳痰法：晨痰、漱口，深咳呼吸道深部痰（非后鼻部分泌物、非唾液）留于无菌容器内。对于痰量少或无痰的患者可采用雾化吸入45 3 5盐水溶液，使痰液易于排出。2 支气管镜采集法：经支气管镜直接吸引支气管肺泡灌洗防污染样本毛刷,下呼吸道标本采集方法（2）,3 胃内采痰法：无自觉症状的肺结核病人尤其婴幼儿不会咳嗽，有时将痰误咽入胃中，可采集胃内容物做结核分支杆菌培养。4 气管穿刺法：主要用于厌氧菌培养5 小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。,痰培养的送检次数,对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续2 3天。不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变；怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检；怀疑军团菌或深部真菌感染，痰标本理想的送检次数尚无定论。,痰培养的运送和保存,所有病人的下呼吸道标本应在采集后立即送至微生物室，并于1小时内接种如不能及时送达，应将标本暂存于4，但放置时间不可超过24h。运输时勿置于冰块中被口咽部菌群污染的标本如咳痰等不可用于厌氧菌培养。室温下放置1h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的分离率而定植于上呼吸道的非致病菌则会过度生长,四、大便培养标本采集规范,#1,#2,接种血平皿，麦康凯平皿，Hektoen或DCA，若怀疑弧菌则还接种TCBS平皿。37 C 空气孵育48h,#3,粪便标本采集后30分钟内进行接种或置于cary-blair运输培养基中,#4,粪便培养重要的病原菌：沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、产毒性大肠杆菌&难辨梭菌（在常规的实验室可能检测不出）,选择血性或脓性的部分进行接种,血平皿上氧化酶阳性的革兰阴性杆菌需进一步鉴定将菌落接种TCBS或含0-6盐浓度的肉汤中。,麦康凯、HEK或DCA平皿上不利用乳糖的革兰阴性杆菌需进一步鉴定。,氧化酶阳性、湿润的米色菌落,革兰染色显示弯曲或螺旋形的杆菌弯曲杆菌属,Campy琼脂,#6, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,#5,将菌落接种至Campy琼脂或使用滤纸法。微需氧环境下37-42 C 孵育 72 h,大便培养标本采集规范（1）,1.采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现症状即采集。2.采集方法：直肠拭子法：用无菌拭子蘸生理盐水湿润，由肛门插入约 67cm，轻轻在直肠内旋动取出大便少许，放入无菌便盒中，加盖封口送检。自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物盛于无菌的、密封的、不吸水的、容器内或直接盛于增菌液或保存液中。,大便培养标本采集规范（2）,3. 注意事项：虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。在患者病情许可的条件下应在用药前采集标本。应床边接种或置输送培养基送检。厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。,五、脑脊液标本采集,脑脊液（CSF)培养主要病原菌：B群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌,最少1ml，最佳5ml,医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和第三管用于微生物学检测。,# 1,1500g离心15分钟（可能的话）,# 2,# 3,用吸管吸去上清，留下1cc的脑脊液沉淀,X,注意：不要倾倒,# 4,滴一滴沉淀于巧克力平皿和血平皿,上下吸取10次以上混匀沉淀,# 5,CO2中孵育72小时,# 6,将一大滴沉淀滴在玻片上。不要涂开。自然干燥并进行革兰染色。如见到大量多形核白细胞则强烈支持感染,# 7, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,脑脊液培养标本的采集,采集时间：怀疑脑膜炎时应立即采集脑脊液，最是在应用抗生素之前采集脑脊液。采集方法：腰穿采集脑脊液35ml（最少1ml，最佳5ml），分装到3个无菌小瓶中（各1 2ml）。 第一管用于细菌培养! 用于细菌和病毒检测时脑脊液量不少于1ml；用于真菌和抗酸杆菌检测脑脊液量不少于2ml。,脑脊液培养标本的采集,标本采集后注入无菌管/小瓶中送检也可将抽取液直接注入血培养瓶,用血培养仪培养。脑膜炎奈瑟菌离体后会迅速自溶,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌也很容易死亡,因此,标本应立即送检,并注意保温、防干燥。切不可置冰箱保存,否则会影响检出率。,脑脊液标本的运送,常温立即送检，实验室收到标本后应立即接种。脑脊液标本送检的理想时间为15分钟内，半小时送检是可接受的，如果送检时间超过1小时，则会影响结果，在结果报告时，在备注处注明此情况。如不能及时送检，可使用血培养瓶（怀疑脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染时，请勿使用血培养瓶）。,六、穿刺液标本的采集,穿刺液类标本的采集,穿刺液培养标本包括胸水、腹水、心包液、关节液、鞘膜液等穿刺液培养标本。采集时间：一般在用抗生素等抗菌药物治疗之前，或在停止使用抗菌药物之后2 3d采集标本。,穿刺液类标本的采集,采集方法： 无菌操作穿刺抽取标本或外科手术采集标本； 标本采集量应1ml。 胸腔积液、腹水可抽取10 ml, 心包液、关节液等可抽取2 5 ml 。 标本采集后注入无菌小瓶或无菌试管中送检，也可将抽取液直接注入血培养瓶,用血培养仪培养。,七、分泌物采集规范,感染伤口的采样方法,组织活检：金标准，可定量培养，用手术刀或穿刺取深部组织活检穿刺抽吸：脓肿，1ml试子,脓，吸取物或组织标本主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓链球菌，其他溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其他革兰阴性杆菌。非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌,用酒精消毒伤口 周围皮肤组织活检是金标准，穿刺抽吸次之最差的标本是拭子,#1,接种血平皿和麦康凯平皿如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通知临床医生,#2,#3,铜绿假单胞菌,中孵育48小时,#4,对1或2种重要病原菌进行鉴定&药敏试验,金黄色葡萄球菌为主,溶血链球菌,肺炎克雷伯菌,混合的2种肠道革兰阴性杆菌：2种均报告；,当检出3种或更多病原菌时，报告“混合菌丛”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,#5,分泌物样本,标本的选择更大程度上依赖于感染的程度和性质而不是可疑的病原体。对大多数开放伤口，采集前应先去除表面菌群。除非有渗出物，干燥、结痂伤口一般不做培养。闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本。开放脓肿处理同开放伤口。烧伤伤口应在广泛清洗和清创术后采集培养。建议取活检标本，伤口表面定量培养不一定有意义。代表性的标本应采自病灶活动区域或基底部而不仅仅是脓液。,分泌物采集规范,1、对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部或边缘的标本分泌物，也可取感染部位下的组织送检。也可对渗出液作厌氧培养。开放病灶不能做厌氧培养。,分泌物采集规范,2、闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。,分泌物采集规范,3、烧伤伤口：清创，出现渗出液后以拭子用力采集，仅作需氧培养。也可送检活检组织标本。4、脓疱或水疱：酒精消毒使之干燥，对于患儿用23号针头挑破脓疱，拭子采集脓疱液和基底部标本。5、标记：不要只写“分泌物”标记标本，应有专门的描述和解剖来源。注明渗出液来自开放伤口还是闭合伤口。,八、生殖道标本采集规范,CO2孵育72h TM培养基上寻找淋球菌，血平皿上寻找酵母菌,# 2,血平皿& Thayer-Martin平皿,# 1,# 1,接种Thayer-Martin培养基&革兰染色,将拭子在玻片上滚动制成一个细胞厚度的涂片；寻找“线索细胞”,C. 怀孕35-37周的孕妇阴道或肛拭子,营养肉汤中孵育过夜血平皿上次代培养检测B群链球菌,# 1,# 2,CO2中孵育48小时,D. 女性的阴道拭子,# 1,血平皿上寻找酵母菌，T-M培养基上寻找淋球菌,革兰染色辅助诊断细菌性阴道病,# 1,# 2,30 min内将拭子置于0.5ml生理盐水中检测滴虫,T-M培养基上的淋球菌,血平皿上的酵母菌,A. 女性的子宫颈或肛拭子,B. 男性的尿道拭子,生殖道标本培养主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌&女性的细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群溶血链球菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,生殖道标本的采集方法,推荐使用男性或女性专用拭子。男性前列腺：用肥皂和水清洗阴茎头，通过直肠按摩前列腺，用无菌拭子收集液体或使液体进入无菌管内。男性尿道：用泌尿生殖道拭子插入尿道腔2 4cm，旋转拭子，至少停留20s。,生殖道标本的采集方法,女性阴道：擦除过多的分泌物和排出液，用2支无菌拭子从阴道穹隆部黏膜处获取分泌物。 1支需要涂片,1支拭子做培养。女性尿道：患者排尿1h后采集，拭去尿道口的渗出物，用拭子通过阴道，靠着耻骨联合，按摩尿道，采集尿液。宫颈：用无润滑剂的扩阴器使宫颈可见，用