细菌的耐药性的产生及检测方法

细菌的耐药性的产生及检测方法,安徽医科大学第一附属医院胡立芬,主要内容,细菌与人类关系抗菌药物应用细菌耐药产生细菌耐药的检测,细菌定义,广义定义：是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌和古生菌两大类群。细菌数量：所有生物中数量最多的一类。细菌广泛存在我们人类体内，人体内及表皮上的细菌总数约是人体细胞总数的十倍。,细菌与人类关系,细菌结构,细菌致病性,细菌在人体内寄生，增殖并引起疾病的特性称为细菌的致病性,侵袭力,胞外酶血浆凝固酶游离血浆凝固酶凝聚因子链激酶: 激活纤溶酶原或胞浆素原,破坏纤维蛋白屏障透明质酸酶：溶解结缔组织透明质酸荚膜: 抵抗吞噬其他表面活性物质: Vi抗原、 K抗原等,毒素,外毒素主要由革兰氏阳性菌产生亲组织性，选择性地作用于某些组织和器官。破伤风杆菌毒素麻痹运动神经肉毒杆菌毒素造成眼及咽肌的麻痹白喉杆菌引起心肌炎、肾上腺出血及神经麻痹等。内毒素主要由革兰氏阴性菌产生无组织选择性，引起的病理变化和临床症状大致相同发热反应糖代谢紊乱影响血管舒缩机能弥漫性血管内凝血,细菌侵入途径、数量与感染,多数病原菌只有经过特定的门户侵入，并在特定部位定居繁殖，才能造成感染。 痢疾杆菌必须经口侵入，定居于结肠内，才能引起疾病。破伤风杆菌，只有经伤口侵入，厌氧条件下，引发疾病。 病原菌的数量与致病能力一般成正比。,主要内容,细菌与人类关系抗菌药物应用细菌耐药产生细菌耐药的检测,抗菌药物产生,抗菌药物的定义,抗菌药物包括：抗生素由微生物（如细菌、真菌、放线菌）、植物和动物在其生命活动过程中所产生人工半合成、全合成的化学药物,抗菌活性,根据不同特性分为：抑菌剂：速效抑菌剂（四环素类、林可霉素类、氯霉素与大环内酯类）和慢效抑菌剂（磺胺类）杀菌剂：繁殖期杀菌剂（青霉菌素类及头孢菌素类）和静止期杀菌剂（喹诺酮类、氨基糖苷类、多粘菌素类）,活性评价指标最低抑菌浓度（MIC）指能够抑制培养基内细菌生长的最低浓度最低杀菌浓度(MBC）指能够杀灭培养基内细菌生长的最低浓度,抗菌药物分类,(1)-内酰胺类：青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有- 内酰胺环。(2) 氨基糖苷类：包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉 素、丁胺卡那霉素、新霉素等。(3) 四环素类：包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。(4) 氯霉素类：包括氯霉素、甲砜霉素等。(5) 大环内脂类：红霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、 阿奇霉素等。(6) 糖肽类抗生素：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁。(7) 喹诺酮类：诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙 星、加替沙星等。,抗菌药物分类,(8)硝基咪唑类：包括甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等。(9)作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、环丝氨 酸、利福平等。(10)作用于G+细菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、 杆菌肽等.(11)抗真菌抗生素：多烯类、咪唑类、三唑类 用于真菌细胞膜上麦角甾醇的抗真菌药物、烯丙胺类、 氮唑类。(12)抗结核菌类：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺等。(13)具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。,抗菌药物作用机理,针对细菌结构，抗菌药主要有5类作用机理：阻碍细菌细胞壁的合成，导致细菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡，哺乳动物的细胞没有细胞壁，不受这类药物的影响。,抗菌药物作用机理,与细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，让细菌内部的有用物质漏出或电解质平衡失调而死亡阻碍细菌DNA的复制和转录，导致细菌分裂繁殖受阻。,影响叶酸代谢 抑制细菌叶酸代谢过程中的二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶。导致核酸合成受阻，从而抑制细菌生长繁殖。与细菌核糖体或其反应底物相互作用，抑制蛋白质的合成,抗菌药物作用机理,主要内容,细菌与人类关系抗菌药物应用细菌耐药性产生细菌耐药的检测,细菌耐药性产生,青霉素的广泛使用后耐药性很快产生(-内酰胺环被破坏后，青霉素的抗菌活性也随之而消失)，随后由于抗菌药物大量使用的压力，针对各种抗菌药物的耐药性逐渐产生。,细菌耐药性又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。,细菌耐药性,20 世纪30 年代末磺胺药上市， 40 年代临床广泛使用磺胺药后，50 年代日本报道80%90%的志贺痢疾杆菌对磺胺药耐药了。,20世纪40年代青霉素刚使用不久即出现耐青霉素金葡菌，50年代发现金葡菌能产生-内酰胺酶灭活青霉素，1961年,甲氧西林问世并投入临床应用(抗金葡菌产生的青霉酶)，从甲氧西林使用10余年后，出现耐甲氧西林金葡菌(MRSA) 报道。,细菌耐药性,6070 年代，细菌耐药性主要表现为金黄色葡萄球菌和一般肠道阴性杆菌由于能产生-内酰胺酶使青霉素类和一代头孢菌素抗菌作用下降。,80 年代后，G-杆菌产生的超广谱-内酰胺酶和AmpC酶，三代头孢菌素在内的多种抗生素耐药的多重耐药革兰阴性杆菌出现。近年来，出现了万古霉素中介金葡菌，2002年以来,美国已先后报道了3株对万古霉素完全耐药的金葡菌。1990年就有耐亚胺培南的一株阴沟肠杆菌报道，但在随后10年期间并未有更多耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌报道，直到2000年后有关 CRE的报道不断增多，一种新抗生素从研制到临床应用一般需要510年，而产生细菌耐药仅需要2 年。,细菌多重耐药,多重耐药：指细菌对常用抗菌药物主要分类的3类或以上药物耐药。泛耐药细菌：指对所有分类的常用抗菌药物全部耐药，革兰氏阴性杆菌对包括多黏菌素和替加环素在内的全部抗菌药物耐药，革兰氏阳性球菌对包括糖肽类和利奈唑胺在内的全部抗菌药物耐药。,超级细菌,超级细菌, 目前引起特别关注的超级细菌主要有：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、耐多药肺炎链球菌（MDRSP）、多重耐药性结核杆菌（MDR-TB）、最近新发现的携带有NDM-1基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌以及多重耐药鲍曼不动杆菌（MRAB）等。超级细菌并非新事物，它们一直存在并且随着人类滥用抗生素而进化出强大耐药性。,“超级细菌”的出现，一度引起了世界的恐慌。在青霉素被发现后的半个世纪，人类走了一圈又回到了原地，来到了多年前有人预测的“后抗生素时代”。我国是世界上滥用抗生素较为严重的国家,耐药菌引起的医院感染人数,已占到住院感染患者总人数的30 %左右。因此有专家预言,我国有可能率先进入“后抗生素时代”，即回到抗生素发现之前的时代。,细菌多重耐药,为此2011 年世界卫生组织（WHO）提出了“遏制细菌耐药，今天不采取行动，明天就无药可用”的口号，细菌耐药已成为一个极其重要的公共卫生安全问题。,细菌耐药基础,固有耐药性：是由细菌染色体基因决定、代代相传，不会改变的，如链球菌对氨基糖苷类抗生素天然耐药；肠道G-杆菌对青霉素天然耐药；铜绿假单胞菌及嗜麦芽窄食单胞菌对多数抗生素均不敏感。 获得性耐药性：细菌与抗生素接触后，在抗菌药物选择性压力存在下经过基因突变、潜伏基因的表达,或细菌在生长过程中通过转化、转导获得抗性基因,或通过移动因子包括质粒、转座子、整合子转移和传播耐药基因而获得的耐药表型,通过改变自身的代谢途径，使其不被抗生素杀灭。如金黄色葡萄球菌产生过多-内酰胺酶或过度表达mecA基因而耐药。细菌的获得性耐药可因不再接触抗生素而消失，也可由质粒将耐药基因转移个染色体而代代相传，成为固有耐药。,获得性耐药性,获得性耐药机制更容易将耐药基因通过水平或垂直传播方式在不同菌株或不同菌种间传播，加速了细菌耐药蔓延的速度，导致耐药菌株越来越多，细菌耐药性迅速上升，使临床上不断出现多重耐药株、泛耐药株甚至“超级细菌”的出现。在上世纪5060年代，全世界每年死于感染性疾病的人数约700万，而现在这个数字上升到了2 000万。死于败血症的人数上升了89%，大部分人死于超级细菌带来的用药困难。,细菌耐药机制,-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中-内酰胺环酰胺键的灭活酶。细菌通过产生-内酰胺酶降解是-内酰胺类抗生素是最常见的耐药方式(80%病原菌耐药方式之一,至今-内酰胺酶数量已超过350余种)Ambler等根据-内酰胺酶分子结构中氨基酸序列差异分为A，B，C,D。1995年Bush等提出功能分类方案，依据酶的底物和酶的抑制物不同，主要分为青霉素酶,头孢菌素酶，广谱酶和超广谱酶四种,A型-内酰胺酶,A型-内酰胺酶按Bush分类法属2群，向下又分为8个亚群(2a,2b,2c,2d,2e,2f,2be,2br)，因此，A型-内酰胺酶在底物动力学性质上显示多样性。大多数青霉素类抗生素都是A型-内酰胺酶的良好底物，如氨苄西林、羧苄西林、苯唑西林和甲氧西林等。从整体上看，A型-内酰胺酶对青霉素类的水解率较头孢菌素类为高，可引起氨曲南和碳青霉烯类耐药。此类酶的活性可被克拉维酸等酶抑制剂所抑制，而EDTA不能抑制，引起临床关注和危害较大的肠杆菌科细菌A类碳青霉烯酶主要是KPC酶。,B型-内酰胺酶,发现于20世纪60年，依赖金属离子发挥催化活性，主要为Zn2+，此酶不被棒酸抑制，被EDTA抑制，其主要特征是除单氨类抗生素（如氨曲南）以外，可水解碳青霉烯酶类等各种 -内酰胺类抗生素，主要包括 NDM-1、IMP、VIM、KHM-1、GIM-1 和 SIM-1。对于产 B 类酶的菌株的尚无很好的治疗手段，值得重视的是对该种酶的检测，以防止其爆发流行。,C型-内酰酶,C型-内酰酶通常被称为头孢菌素酶1989首次发现，按Bush分类法属1群。第1代头孢菌素是C型-内酰胺酶的良好底物，第2、3代头孢菌素一般对C型-内酰胺酶不敏感。亚胺培南和氨曲南则表现出对C型-内酰胺酶的抑制作用。主要包括CMY、FOX、MOX、LAT、ACT、ACC、MIR和DHA,D型-内酰胺酶,D型-内酰胺酶Bush分类属2d群，它们对苯唑西林和氯唑西林的水解速度明显大于苄青霉素，因此，它们又被称为“苯唑西林酶”，其中OXA-48 在碳青霉烯类耐药中显示出了日趋重要的碳青霉烯酶的活性。,超广谱-内酰胺酶,ESBLs是一大类基于TEM-1、TEM-2和 SHV-1型内酰胺酶基础上经突变而成的多种-内酰胺酶，水解青霉素、广谱青霉素、头孢菌素、单环类、第四代头孢菌素，但不能水解碳青霉烯类、头霉素类。除了对内酰胺类抗生素耐药外，经常伴随对氨基糖苷类等其他抗生素的耐药性。准确区分ESBLs和非ESBLs菌株，不仅可指导临床合理用药，以免延误病情和增加医疗费用，而且有利于对ESBL菌株的管理，控制其传播，防止爆发流行，对提高治疗效果和控制医院院内感染均有重要意义。,AmpC酶,G-杆菌产生的不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶组成的一个酶家族,属于-内酰胺酶分子分类中的C类。产AmpC酶的耐药菌几乎对所有的-内酰胺类药物耐药,对第4代头孢菌素如头孢吡肟敏感,对碳青霉烯类如亚胺培南、美罗培南有高度的活性。 AmpC酶可分为质粒介导型和染色体介导型。质粒AmpC基因来源于几种肠杆菌科细菌染色体AmpC基因,其AmpC没有调控基因,呈持续高表达,且质粒编码常同时携带有其他的耐药基因,因而导致多重耐药,并且传播很快,主要在大肠埃希菌、肺炎克雷白杆菌、沙门菌属和志贺菌属中出现。染色体介导的AmpC酶能水解第3代头孢菌素等-内酰胺类抗生素,其高水平表达与调节基因突变有关 ,当AmpD基因突变产生有缺陷的AmpD蛋白时,可引起AmpC过度表达,使产酶量大增引起耐药,多见于阴沟肠杆菌。,氨基糖苷修饰酶,乙酰基转移化酶(AAC)、磷酸转化酶 (APH)和腺苷酸转化酶(ANT)。人们一直认为耐药菌株产生的氨基糖苷类修饰酶是主要的耐药机制，但临床分离致病菌株16S rRNA甲基化酶的发现改变了人们的观点。此酶可由质粒介导进行垂直和或水平播散，使细菌对氨基糖苷类抗生素产生多药交叉耐药及高水平耐药，给临床医生治疗革兰氏阴性杆菌感染带来更加严峻的挑战。,抗生素作用的靶位点发生突变,细菌通过对特定位点的突变，改变了与抗菌药物结合位点的结构，或产生了新的不能与抗生素结合的替代物质，或产生了保护性的物质阻止了抗生素的结合而逃避抗生素的作用。链霉素 结合部位是30S亚基上的SI2蛋白,若SI2蛋白的构型改变,使链霉素不能与其结合而产生耐药性；红霉素 靶部位是50S亚基的L4或L12蛋白,当染色体上的ery基因突变,使L4或L12蛋白构型改变,便会出现对红霉素的耐药性；利福平 作用点是RNA聚合酶的基因,当其突变时,就产生了耐药性；青霉素 靶部位是细胞膜上的青霉素结合蛋白(PBPs),PBPs具有酶活性,参与细胞壁的合成,是-内酰胺类抗生素的作用靶位,细菌改变了PBPs的结构,可导致耐药性；喹诺酮类药物 靶部位是DNA旋转酶,当基因突变引起酶结构的改变,阻止喹诺酮类药物进入靶位,可造成喹诺酮类所有药物的交叉耐药。,外膜通透性改变,一些具有高渗透性外膜、对抗菌药物原来敏感的细菌,可以通过降低外膜的渗透性而出现耐药性。如原来允许某种抗菌药物通过的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。此种耐药机制往往对抗菌药物特异性较差，具有多重耐药性，铜绿假单胞菌的外膜对多种抗菌药物如内酰胺类、酶抑制剂、四环素、氯霉素和喹诺酮类的通透性极低，而导致先天耐药。,主动外排作用,主动外排作用是微生物对药物产生耐药性的一个重要机制，源于20世纪80年代关于大肠埃希菌对四环素耐药机制的研究,它是由药物外输泵来完成的。 药物外输泵是一类位于细胞膜上的具有特殊结构的膜转运蛋白质，其作用机理为当细胞内的药物浓度聚集达到一定数值时，药物外输泵系统相关mRNA 的表达增加，结果使细胞膜上外输泵的数量增加,使细胞内的药物被泵出。外排系统广泛存在于G+ 菌、 G-菌、真菌及哺乳类细胞(如癌细胞)中,其与细菌外膜通透性改变在多重耐药中起重要作用, 愈来愈受到研究者重视。,细菌生物膜的作用,细菌生物膜(BF)是指细菌吸附于生物材料或机体腔道表面,分泌多糖蛋白复合物,并将自身包绕其中形成的膜样物质。 细菌在BF的保护下可逃避抗菌药物的杀伤作用和免疫细胞的吞噬作用。与浮游菌比较,BF细菌对抗生素的抗药性可提高101000倍,其主要取决于BF多细胞结构: BF中的胞外多糖起屏障作用,限制抗生素分子向细菌运输; BF中微环境的不同可影响抗生素的活性; BF细菌表面生长可诱导细菌表达出与浮游细菌不同的基因,诱导产生BF特异性表型; 多菌种BF中各菌种的协同作用。具有生物膜的细菌多见于铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、变异链球菌。,转座子介导的耐药性,转座子(Tn)是一种比质粒更小的DNA片段, 它能够随意地插入或跃出其他DNA分子中, 通常借助细菌的染色体、噬菌体或质粒得以复制并插入到新的位点,或将自身从原位点剪切掉再插入到新的位点,从而使宿主细胞失去对抗菌药物的敏感性。 在细菌对万古霉素的耐药性机制研究中发现VanA 基因存在于Tn1546中,这一转座子含有9个基因,其中有2个编码万古霉素耐药基因的“VanA基因簇”。Tn还可以使位于染色体上和非接合质粒上的基因转移到接合质粒中,实现细菌间的基因转移或交换。此外,耐药基因的转移和传播也可以通过转座子、整合子和质粒等可移动的遗传元件介导。,细菌整合子系统,整合子( integron)是近年来发的新的可移动基因元件,是捕获外源基因并使之转变为功能性基因的表达单位。整合子的基本结构由1个编码整合酶的基因、2个基因重组位点、启动子和耐药基因盒组成。基因盒是单一的可移动的DNA分子, 是由一个开放阅读框(ORF基因)和一个反向不完全重复序列即59-碱基(59-be)单元组成,59-be是整合酶的识别位点。只有当基因盒被整合子捕获并整合到整合子中才能转录,一个整合子可以捕获一个或多个基因盒。,主要内容,细菌与人类关系抗菌药物应用细菌耐药性产生细菌耐药的检测,耐药检测标准,美国国家临床实验室标准化委员会(CLSI) 针对每种细菌CLSI会提供质控参考菌株 的MIC，检测的药物种类，敏感、中介和耐药的浓度,琼脂稀释法(MIC 法),琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。,纸片扩散法,纸片扩散法又称琼脂扩散法，将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。,Etest试验,金标准的药敏方法,它的特点是结合琼脂扩散法和稀释法的优点,浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。 是用扩散法的原理,塑料条的形式定量读出MIC值。这比传统的纸片扩散法测抑菌圈的大小精确可靠。,自动分析仪,自动分析仪器 待鉴定细菌 药敏卡,ESBLs检测,纸片确认试验：CLSI标准，CAZ/CLA，CTX/CLA两组药敏纸片确认，结果抑菌环直径差值5mm。E-test法：一端是CAZ(0.5-32ug/ml),另一端是CAZ(0.125-8ug/ml) /CLA(4ug/ml), CAZ与CAZ/CLA的MIC比值4。,PCR 方法检测耐药基因,单重PCR：细菌耐药性的灵敏性和特异性明显高于传统药敏实验。最大不足之处在于检测的指标过于单一。多重PCR方法检测耐药基因：多重PCR 可以实现多目标耐药基因的检测。,基因芯片在耐药基因检测,DNA 芯片与多重PCR 结合, 可用于多种耐药基因的检测。临床革兰氏阴性细菌, 尤其肠杆菌科细菌中, 由于超广谱-内酰胺酶以及头孢菌素酶的流行, 导致致病菌对主要的一线常用药- 内酰胺类抗生素高度耐药。因此对介导这些耐药的耐药基因进行检测, 有很大的临床意义。,基因测序,Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。第二代测序技术是费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，应运而生，二代测序的基本原理是边合成边测序。,MRSA,纸片扩散法:苯唑西林在贮存过程中药效不易降低，且对不均一耐药性检测效果更好，所以国内多数实验室都采用苯唑西林，苯唑西林含量为1g/片，抑菌圈10 mm为耐药，13 mm为敏感，1112 m