分子生物学课件

第一章 绪论,一、分子生物学是生物学研究的一个分支,分子生物学即从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。,二、分子生物学发展历史,1、分子生物学诞生的准备阶段 确定了蛋白质是生命的主要基础物质。 确定了生物遗传的物质基础是DNA2、现代分子生物学建立 1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型是现代分子生物学诞生的里程碑, 遗传信息传递中心法则建立。,遗传信息传递的中心法则,基因信息的传递中心法则修正的中心法则:,3、20世纪70年代以来分子生物学飞速发展,、逆转录酶的发现；、一些工具酶的先后发现；、断裂基因的发现；、DNA测序方法建立；、核酶的发现；、PCR技术建立；、基因的上游调控序列发现；、显微注射技术运用；、基因重组技术发展、基因治疗技术发展；、人类基因组计划实施,三、分子生物学研究的内容,1、DNA重组技术,2、基因表达调控研究 、信号转导研究； 、转录因子研究； 、RNA剪接研究,3、生物大分子结构功能研究,4、基因组、功能基因组与生物信息学研究,四、医学分子生物学,医学分子生物学是从分子水平研究人体和疾病相关生物在正常和疾病状态下生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的科学。,第二章核酸分子结构功能,第一节 概 述,第二节 核酸的分子组成,第三节 核酸的分子结构,第四节 核酸的理化性质,核酸（nucleic acid）： 是一类由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接而成的生物大分子，是一切生命体的重要组成成分。包括核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）。,一、核酸的概念,第一节 概 述,核酸,RNA,DNA,mRNA,tRNA,rRNA,其它非编码RNA,二、核酸的分类,三、核酸的生理功能,1、作为遗传物质：DNA为主，RNA为辅,2、参与蛋白质的生物合成,3、有些核酸具有“催化”功能。,磷酸,戊糖,碱基,核苷酸的组成,第二节 核酸的分子组成,核苷酸,核苷,核苷是指碱基与核糖通过糖苷键连接而成的化合物。,脱氧核苷是指碱基与脱氧核糖通过糖苷键连接而成的化合物。,核苷酸是指核苷分子上的羟基与磷酸分子脱水而成的化合物。,脱氧核苷酸是指脱氧核苷分子上的羟基与磷酸分子脱水而成的化合物。,第三节 核酸的分子结构,一、核酸的一级结构,是指核酸分子中核苷酸的排列顺序，连接核苷酸分子的化学键是3,5-磷酸二酯键,AGCTTGGCAGACTGCTAAGGGGTCCCCAAAT,AGCUUGGCAGACUGCUAAGGGGUCCCCAAAU,核酸的一级结构,是指由脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接而形成的长链分子。,DNA,DNA的碱基组成符合Chargaff 规则：,A+G=C+T，A=T，G=C,DNA碱基组成有物种差异,无组织差异,不随营养、环境与年龄改变,DNA的二级结构（DNA双螺旋结构）,1953年由Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，其特点为：,2条反向平行的互补DNA构成右手螺旋, 磷酸-脱氧核糖位于双螺旋的外侧,碱基 对位于内侧, 双螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm, 每个螺旋需10个碱基对，每个碱基对相 隔0.34nm;且碱基对平面与螺旋轴垂直,碱基互补方式是A与T互补，形成2个氢 键，G与C互补，形成3个氢键,稳定因素:碱基对形成的氢键和碱基堆力,是指在DNA的二级结构基础上，DNA双螺旋进一步盘旋折叠形成更加复杂的结构,DNA的三级结构,RNA,mRNA,tRNA,rRNA,其它非编码RNA,RNA的碱基组成是A，G，C，U，一般为单链，所以没有象DNA一样从头到尾都是双螺旋结构，但它可以自身回转形成部分互补的双螺旋，从而形成发夹结构。,在蛋白质生物合成中作为蛋白质合成的直接模板。,mRNA,在蛋白质合成过程中将氨基酸搬运到核蛋白体，为蛋白质合成提供原料。,tRNA,tRNA二级结构具有四环四臂,在蛋白质合成过程中与多种蛋白质在一起构成核蛋白体，为蛋白质合成提供场所。原核生物含有5S，16S和23S的rRNA真核生物含有5S,5.8S,18S和28S的rRNA,rRNA,细胞核中还有很多未知功能的RNA。大规模的测序和全基因组DNA微阵列分析结果表明，人类基因组中约50%的基因组序列能转录为RNA，其中只有2%的序列编码蛋白质，其余98%是不编码蛋白质的非编码RNA。,其它非编码RNA,核酶是指具有催化作用的RNA。,第四节 核酸的理化性质,一、核酸的紫外吸收特征,二、核酸的变性与复性,三、核酸的杂交,核酸紫外吸收特征,核酸的特征紫外吸收波长为260nm，是由碱基引起的。,核酸的变性与复性,是指在理化因素作用下，DNA双螺旋结构遭到破坏的过程。,核酸的变性,核酸在受热情况下的变性称为热变性，又称退火,变性核酸存在增色效应。,增色效应,是指变性核酸其A260增大的现象。,Tm值是指热变性过程中变性一半时的温度。,Tm值的高低与核酸中GC对的含量相关。,是指变性核酸在去掉变性因素后又恢复其双螺旋结构的过程。,核酸的复性,复性DNA存在减色效应。,减色效应,是指复性核酸其A260减小的现象。,是指不同来源的变性核酸在去掉变性因素后其互补序列形成双螺旋结构的过程。,核酸杂交,第二章基因,一、基因的分子生物学定义p43,基因是负责编码RNA或一条多肽链所必需的全部核酸序列（通常指DNA序列）。,基因组（gencme） 细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和称为基因组。p53 人类基因组包含22条染色体和X、Y两条性染色体上的全部遗传物质（核基因组）以及胞浆线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。 不同生物基因组结构与组织形式上有巨大差别，病毒基因组结构简单，所含结构基因很少；原核生物基因组所含基因数量较多，且有了较为完善的表达调控体系；真核生物基因组所含基因数量巨大，表达调节系统也更为精确。,二、结构基因,概念 基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因。结构基因中DNA双链中的一条链可以作为合成RNA的模板链，称为反义链，另一条链称为编码链，又称有义链或信息链。原核生物的结构基因是连续的，其转录后的RNA是不需要剪接加工的。真核生物的结构基因的显著特点是编码区内含有非编码的插入序列，因此被称为不连续基因或断裂基因。,真核生物结构基因的编码序列称为外显子，在基因转录后经剪接连在一起。非编码序列被称为内含子，又称为插入序列。在不同基因中内含子和外显子的数目和大小各不相同，根据人类基因组草图的分析推测，基因的编码序列仅占全基因组序列的3%。内含子存在意义：有研究表明有些基因的内含子的存在可以保证或增强基因的稳定表达；还有些基因的内含子中包含有其他基因的编码序列（即基因内基因）。,1、基因突变类型及其遗传效应？,三、基因突变P133,由于体内外各种因素改变了某基因特定的DNA序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一级结构发生改变，改变了基因结构即基因突变。其分子机制可以是替换、插入或缺失，因而产生不同的突变类型。,(一) 基因突变的多种类型,点突变是单个碱基的改变：转换和颠换缺失是一个或多个核苷酸的丢失插入是一个或多个核苷酸的增加倒位是一段核苷酸序列方向倒转基因突变还分为配子突变与体细胞突变动态突变指串联重复序列（拷贝数）随世代的传递而改变。,基因突变引起遗传密码的改变：根据基因突变产生的遗传效应不同分为,(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应,a. 同义突变 (consense mutation),b. 错义突变 (missense mutation),c. 无义突变 (nonsense mutation),d. 移码突变（frame-shifting mutation）,同义突变(same sense mutation)：密码子发生改变, 但所编码的氨基酸不变。,例如：CUU CUC CUG 亮氨酸,错义突变（missense mutation） 指DNA分子中碱基的取代，经转录产生的mRNA后，相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸组成和排列顺序发生改变。,由于碱基的取代、缺失或插入，使原来编码某种氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变 (nonsense mutation) 。,亮氨酸的密码子UUA，中间的U变为A这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）UAA。,酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便到此停止。,无义突变：,指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基（但不是三联体密码子及其倍数），在读码时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。移码突变造成的肽链延长或缩短，取决于移码终止密码子推后或提前出现。,移码突变(frame-shift mutation),(2) 基因突变影响 hnRNA 的剪接,基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。,(三) 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病,1. 血红蛋白病 (hemoglobinopathy)： 血红蛋白(hemoglobin, Hb)的结构特点 珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达,镰状细胞性贫血：正常成年人血红蛋白中的链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致异常血红蛋白的生成造成镰状细胞性贫血。地中海贫血: 地中海贫血主要是由于基因的点突变（少数为基因缺失）可致链的生成受抑制，称地贫。珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。,2、什么是转基因动物？,转基因技术概念,转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机重组的发生而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA上的过程。 利用转基因技术可以制备转基因生物。通常所指的转基因生物是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，使外源基因通过随机重组插入到受体细胞的染色体上，并随细胞的分裂而将外源基因遗传给后代。,一、转基因动物,转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源基因的动物。 转基因过程：1、转基因载体的构建；2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞；3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内；4、对转基因动物进行鉴定。,转基因载体,结构基因,报告基因,增强子,启动子,受精,全能性细胞,注射,植入,假孕小鼠,后代,Southern blot,RT-PCR,Western blot,转基因小鼠,转基因动物应用：,1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达的时相；2、在活体内研究或发现基因的新功能；3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究；4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型；5、遗传性疾病的研究；6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；7、动物新品种的培育；8、基因工程产品的制备；,3、什么是PCR技术？PCR的基本原理是什么？,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,1983年,Mullis发明了PCR技术。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首, Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B. Mullis（1944）,,聚合酶链式反应简称PCR (P353)（Polymerase Chain Reaction） 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增 。,体内DNA的复制,复习,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,2 PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2 ）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,3 ）用途广泛,生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学,1、为什么DNA的复制是半保留半不连续复制？P103 P109,半保留即母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA,一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。,半不连续复制是由于DNA双螺旋的两股单链是反向平行，一条链的走向为5-3,另一条链为3-5,DNA的两条链都能作为模板以边解链边复制方式，同时合成两条新的互补链。但是，所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5-3，所以在复制是，一条链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制，称为领头链；,另一条链的合成方向与复制叉前进方向相反，不能顺着解链方向连续复制，必须待模板链解开至足够长度，然后从5-3生成引物并复制子链。延长过程中，又要等待下一段有足够长度的模板，再次生成引物而延长，然后连接起来，这条链称随从链。因此就把领头链连续复制，随从链不连续复制的复制方式称为半不连续复制。,2、简述乳糖操纵子的正负调控机制。,基因表达主要包括（基因）转录和（蛋白质）翻译使信息分子DNA转变成有功能蛋白质的过程，这一过程在体内受到精密的调控，以保证功能的有序性。这一调控称为基因表达的调控，简称基因调控。 基因表达过程分为基因活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工等阶段。在上述各环节都存在基因表达调控的控制点。,基因表达调控,第一节 原核生物基因表达调控,一、转录水平的调控是原核生物的主要调控环节,原核生物基因多以操纵子形式存在。操纵子由调控区和信息区组成。上游调控区包括启动子与操纵元件二部分。启动子是同RNA聚合酶结合并启动转录的特异性DNA序列，操纵元件是特异的阻遏物结合区。,影响原核生物转录的因素,1、启动子 2、因子的种类与浓度 3、阻遏蛋白 4、正调控蛋白 5、倒位蛋白通过DNA重组倒位而调节基因表达 6、衰减子 7、RNA聚合酶抑制物,操纵子模型的提出 莫洛(Monod)和雅各布(Jacob) 获1965年诺贝尔生理学和医学奖,（1）人们早在上个世纪初就发现了酵母中酶的诱导现象。即分解底物的酶只有底物存在时才出现。酶受底物的诱导，这种可诱导现象在细菌中普遍存在。 在培养基中加入适合底物-乳糖或半乳糖后23分钟，一半乳糖苷酶可迅速达到5000个酶分子，增加了1000倍，占细菌蛋白总量的510%。 (一半乳糖苷酶水解乳糖半乳糖+葡萄糖 2个单糖)。 若撤消底物，该酶合成迅速停止，就象当初迅速合成一样。从60年代乳糖操纵子模型提出1966年分离得到该操纵子的阻遏蛋白1975年乳糖操纵子的碱基序列已全部测定清楚了。,1.乳糖操纵子的调控机理（可诱导的操纵子）,（2）乳糖操纵子（Lactose operon ，La