【毕业学位论文】（Word原稿）林烟草抗烟草花叶病毒(TMV)N’基因的信号传导途径研究

兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 第一章 前言 牧 草 产 业在国民经济和生态环境中具有重要的地位和作用。 目前， 全国草原承包 面积占可利用面积的 70%。 2002 年以来 国家先后启动了天然 草原植被 恢复 、草原围栏、草种基地建设等项目，项目区草原生态得到明显恢复，取得良好效果。但是 ，病害 对 我国 牧草生产造成了巨大的经济损失。 烟草花叶 病毒 病 （ 是 烟草 主要 病害之一， 可以侵染红豆草，苜蓿等豆科牧草，给我 国牧草 生产造成了严重的影响，同时也对草地植被的健康成长造成了危害，大大缩短了天然草地的利用年限。 植物基因工程 是 20 世纪 80 年代 兴起的新技术，它的发展为牧草改良提供了新的手段 。 用 基因 工程改良牧草有几个 优点 ： 一是转基因技术已经成熟，农杆菌介导法已成为常规技术 ， 成功地用于牧草转化；二是抗旱苜蓿已在生产上 开始 应用，积累了丰富的经验；三是转基因牧草主要在极端环境 条件 下 栽培， 可 用于改善 环境 。 从解决目前育种和生产中的两个重要问题而言，由于对植物防卫反应的机制的认识还很匾乏，缺乏可用的相应基因，因此上游工作的不足是牧草基因工程技术应用的“瓶颈”所在。 烟草的野生品种 林烟草 （ 的 N基因 可以 对烟草花叶病毒产生抗性。 林烟草被 烟草花叶病毒侵染后，其叶片会产生超敏反应， 将 烟草花叶病毒限制在被侵染叶片中，而同一株的其它叶片则不会产生花叶 症状 。 因此 ，对 N基因 的研究备受关注。 基于这些认识， 为 确定林烟草 N基因对 病信号途径 。本论文以林烟草为材料， 从中分离 了植物 防卫反应调控元件的编码基因 构建了 这 8 个 基因的 物表达载体并遗传转化林烟草 ，希望这部分工作能为我国牧草抗病和品质改良 的基因工程提供有用的基因资源和元件。 目前植物中调控抗病反应的途径主要有水杨酸 (A)、茉莉酸(乙烯 (T)途径 ( 2003)。 尽管植物受到不同病原的浸染 ， 但似乎都是以一条共同的信号传导网络来调控抗病反应(et 2006; et 2008)。研究这些途径的 上述 抗性反应调控 元件 的特性 , 可以为植物的持久、广谱性的抗性机理提供依据。 兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 第二章 文献综述 草花叶 病毒 烟草花叶病毒 (于烟草花叶病毒属，是世界上第一个被发现的病毒 ， 对 其 的研究历史已超过 110 年，极大的促进了病毒学甚至整个生命科学的发展，是病毒学领域的“开拓者” (et 1999； et 2011)。 草 花叶病毒的寄主范围 侵染 苜蓿、红豆草等 豆科 、 十字花科、茄科、菊科及苋科共 36 科350 种植物。 草 花叶病毒的结构及基因 组 组成 常稳定， 其稳定性主要是由于紧密的病毒粒子结构造成的， 提纯的病毒粒子在 5条件下至少可以保存 50 年。它的病毒粒子由一条单一的基因组子构成，包裹在在其圆柱形的外壳蛋白中 (et 1999; et 2011)。 世界上第一个被完整测序的植物 毒。 1982 年， 首次完成了 通株系 (基因组序列（ 6395 测定 (et 1982)； 因组呈单链线性，含有 6400 个碱基 ， 编 码了四种蛋白 复制酶（ 30运动蛋白（ 外壳蛋白（ 。 为烟草花叶病毒复制酶的组成部分 (1986)，是从基因组 接翻译得到的； 通读 终止子得到的 (1978)。 别从 基因组 译得到。基因组 5非翻译区 (端为 子结构，而 3叠形成类 构，末端 (3常与组氨酸 (价连接(et 1999)。 兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 图 因组结构图 上图显示基因组 部显示含有共同 3末端的亚基因组。由开放阅读框架编码的蛋白质的分子量以千道尔顿标出，未知功能的独立基因也被标明（假定的 54星号表示通读密码子 (1999)。 草花叶 病毒的传播方式 及 危害 在我国烟草上， 能借助昆虫、线 虫或其它载体传播， 主要是通过田间的农事操作进行传播，并且 传播流行特点上表现为积年流行病害，所以在生产上多数表现为逐年加重的现象。 染 豆科牧草 造成 的 苜蓿花叶病（李梦钗等 ， 2005；南志标 ， 2001） 。 由核酸 (外壳蛋白 (成 ， 由于其核酸中含有致病基因而对寄主植物具有致病性 。 植物病毒是通过核酸基因组插入或整合到寄主细胞的核酸基因组中 ， 引导寄主的核酸基因组复制出大量病毒组成的核酸分子和蛋白亚基 ， 再利用寄主细胞的酶系统将其核酸与蛋白质亚基组装成病毒 粒体 ，因此病毒对寄主的危害并不是与寄主争夺养分或产生毒素 ， 而是通过干扰寄主细胞的正常代谢途径或代谢过程 ,促使细胞产生一些对正常生命活动有害的物质造成的 （沈建国 ， 2005； 陆家云， 1997）。 染寄主后 ， 导致寄主生理代谢异常 ， 进而引起细胞结构变化 ， 造成寄主光合作用 、 呼吸代谢 、 核酸代谢 、 蛋白质代谢 、 激素失调和花叶 、 变色 、 环斑 、 坏死和畸形等症状的形成 。 一般年份 ， 植物病毒病可使农产品减产 20%一30%， 严重的年份减产达 50%以上 ， 甚至绝产 ， 而且对农产品品质造成不同程度的影响 ， 已经严重阻碍了农业生产水平的提高 （何 永明， 2007；刘 国坤， 2003）。 目前，对 烟草花叶病毒的防治主要有药剂防治、 利用 植物天然提取物防治 和选用 抗病品 种，其中转基因育种是最有效便捷的方法 。 物 抗病基因 兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 物 抗病 基 因 种类 根据 抗病 基因 编码 蛋白质 保守结构域的不同，大多数植物抗病基因归为 5类 （王友红 等， 2005）： 即核苷酸结合位点和富亮氨 酸重复的胞内受体蛋白； 根据 核酸结合 位点 前端 (的不同结构， 码的这一类基因在植物中主要被分成两大类 (et 1999) ， 型基因 和 非 型 基 因 。即胞外富亮氨酸重复的跨膜受体蛋白，如 。即胞 外 富 亮 氨 酸 重 复 和 胞 内 的 丝 氨 酸 / 苏 氨 酸 激 酶 ， 如 即丝氨酸 /苏氨酸激酶，如 。 物抗病基因的结构 根据 生物信息学分析，目前已克隆的 大部分 抗病 基因编码蛋白同属于族。 白最常见的结构域，在这两个结构域中还有一个R 构域 (1998)。 构域共同组成一个核酸结合口袋，这个口袋可以结合、水解 et 2002)。 包含一些功能未知的保守结构域，这些结构域可能参与下游防卫信号的激活。当 白的 构域过量表达的时候，可以非常有效的诱导植物发生防卫反应 (2007; et 2008)。 根据 N 端结构域之间的不同特征， 白主要被分为两类 (et 2002; et 1999)。第一类 白的 N 端含有类果蝇 白/白细胞介素 体结构域（ 被称作二类 白的 N 端含有一个复式螺旋（ 构域，因此被称为 白的 N 端结构域被当作信号区域 (2007)。实际上，一些 构域的过量表达可以诱导防卫信号 (et 2004; et 2009)，但是目前没有报道 构域的过量表达有相似的功能。 白的 C 端是富含亮氨酸的重复区（ (1997)。 构域参与并特异识别 白 (et 1998; et 1998; 2002; et 1999)。 同的结构域之间存在 互作。 构域都和它们各自的 N 端相互作用 (et 2007; et 2005; et 2002; 2006; et 2006)。 构兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 域也和 构域发生功能互作 (2006)。 物抗病基因作用方式假说 R 蛋白与 子的 特异性互作是 生 的 必要 条件 ，而其 互作 主要 存在两种模式 ： 直接 作用 模式 与间接作用 模式。直接 作用 模式即激发子 /受体模式：子 （激发子）直接与 R 蛋白（受体）相互作用，从而触发受侵染部位细胞内的信号传递过程，激活其他防卫基因的表达，产生超敏反应。 植物 R 蛋白也可以间接的识别病原物 白，即 间接 作用 模式 。 目前科研人员针对此模式提出如下 3 种假说。 1）防卫假说：病原物 因编码的蛋白主要作用于“卫兵蛋白”，抑制植物的防卫反应。 R 蛋白发现卫兵蛋白受到攻击后，能激活植物的防卫反应，限制病原物在植物体内的扩散 (2001; 1998)。如：丁香假单胞菌的 拟南芥的 白（卫兵蛋白）相互作用，激活了 白 et 2002)； 切 以激活 蛋白 2003; et 2003)；切拟南芥的 白，可以激活 蛋白 et 2003)； 马铃薯的 白相互作用，可以激活 蛋白 2003)。 2）“陷阱”模型：病原物 因编码的蛋白（也称为病原物效应子）误将与靶蛋白相似的蛋白作为靶标，即假靶标充当了病原物效应子的陷阱。假靶标只是误导 别，并没有具体的功能。假靶标的出现是自然选择的结果，当植物含有 R 基因时，保卫蛋白与病原物效应子相结合，增强对病原物的识别；当植物不含 R 基因时，假靶标与病原物效应子竞争性结合，保卫蛋白倾向于不和效应子蛋白相结合，避免被效应蛋白修饰。假靶标和病原 物效应子结合后，不会引发抗病反应，但不会增加植物的感病性 (2008)。 3）诱饵开关模式： R 蛋白通常处于失活状态。病原物效应子先和“诱饵蛋白”相互作用，当 R 蛋白监视到诱饵蛋白发生变化后， R 蛋白的 构域结合 除分子内的相互作用， 构域从失活状态转变为活动状态，即开关被打开，进而激活防卫反应。 物抗病基因作用途径 当植物的 R 基因和病原物 因发生互作后，植物被侵染的组织会产生而诱导未被侵染的植物组织产生抗性 ，即系统获得抗性（ 产生经历了一个错综复杂的过程，需要植物防卫信号的转导。植物主要的防卫信号途径至少有两个：水杨酸（ 赖途径和非 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 依赖 （ 茉莉酸 /乙烯（ ） 途径 (998;001)。 径 ： 介导植物局部防卫反应（ ， 诱导植物产生 信号分子。当植物受到侵染后，侵染点附近细胞中的 量上升。随后，植物其它组织中的 量也会上升，一些 程相关）蛋白开始表达，诱导植物产生系统抗性。在植物与病毒互作中， 没有通过降低胞间连丝的排阻极限来抑制病原物 在体内的扩展 ，但 却 对病原物在表皮细胞间运动产生抑制作用(2002)。 水杨酸羟化酶可以使 成儿茶酚，减少 植物体内的积累。当 因后，不能积累 病性增强。尽管这些转基因植株细胞仍然发生 是在接种 et 2000;et 1997)。 对感病烟草植株进行阿司匹林或者 理，可以减少其体内的积累 ( 1997; et 1983)。在 导下，被染过的心叶烟（ 成胼胝质，可能用来影响胞间连丝的通过能力，提高抗病性 ( 2002)。在被 染的 因型烟草中，伤诱导蛋白激酶）被激活，当把这种物质以纳摩尔的浓度应用在叶片上时， 导蛋白激酶）被激活，相关防卫基因的转录子不断积累，叶片对 染的抗性增强 (et 2003)。 径： 携带 陷基因的寄主植物在受到软化腐烂真菌侵染时，感病性并没有增强，这说明植物还有其它一些防卫途径， 即 径。 在拟南芥中， 同调控 因的表达， 如 其中 表达伴随着 号途径的激活。在茉莉酸的合成过程中，会产生有生物活性的中间体，类似于茉莉酸的衍生物。这些化合物影响各种生理过程，包括果实成熟、不同花粉的产生、根的生长、卷须盘绕、植物对昆虫和病原物的防卫反应 (1997)。 诱导系统抗性（ 是必需的。 防卫反应中的功能是由 现的，他们提供了植物受伤、茉莉酸形成和蛋白激酶抑制子基因诱导之间的证据 (1992)。茉莉酸在植物受到伤害和昆虫取食时产生的反应中有重要作用 (1995)；而乙烯和茉莉酸能够相互作用，诱导马铃薯对损伤产生反应 (O1996)。当植物受到伤害时，乙烯会在叶片中瞬间迅速的产生。通过采用突变体或者涂抹化学抑制子，可以抑制植株乙烯的产生或者对乙烯的敏感性 ，都会对茉莉酸途径的诱导产生负面影响。 物 抗病 反应的 信号元件 在植物的防卫信号转导途径中，不管是 径还是 径，都有很多信号 元件 调节 者 生成、积累，促进或者抑制这些途径，从兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 而影响植物产生抗性。 肽酰精氨酸脱亚氨酶类 ( 可以 催化肽酰精氨酸残基转变为瓜氨酸残基 ( 目前 已经 知道，部分结构蛋白质经瓜氨酸化修饰后与相关疾病病理机制有关 （何香 ， 2010） 。 脂肪酶 因缺失导致 R 基因介导的抗病信号阻断 ( 2000) 。 因产物与甘油三酰脂酶有一定同源性 , 能与信号分子的合成和降解有关（ 1998）。 能与某些信号分子合成和降解有关，它们在 上游将抗病信号放大。 理能增加 因的表达，说明 以正向反馈调节这两个基因的表达。 与了一个上调调节环路，这个环路增加了 此激活了 赖的防卫反应 (et 1999)。 三酰甘油脂肪酶基因同源，是一种脂肪酶蛋白，对于抗病基因介导植物抗性是必不可少的(et 2001; et 1999)。 因缺失导致植株更加感病，不能诱导 因的表达以及 积累。 另一种脂肪酶，可以水解某种脂质底物而起作用，可以介导 R 蛋白产生抗性 (et 1998)。经过序列比对，本生烟的 拟南芥的 有保守的丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸残基 (et 1999)。 病程 相关基因 非 表达子 1（ of , 调 控 植物病害 抗性 的一个关键基因， 是 植物基础抗性 以及 植物抗病基因决定的抗性的重要调控因子 ， 在调 节 和平衡 水杨酸和 茉莉酸 信号 转导中起关键作用 （ 张红志 , 蔡新忠 ， 2005） 。 非表达 因可以编码 游的信号组件，抑制 积累，是 径一个重要的调控蛋白， 叫做变体不能表达防卫基因 ao et 1994; et 1995; et 1997)。 结合于 动子的转录因子互作，表明能会改变防卫基因转录因子的活性 (et 1999)。 组成型三重反应突变体（ , 乙烯突变体 的一种， 在 没有乙烯处理的条件下， 能缺失型突变体的白化苗和成株都表现出组成 型的乙烯反应，表明 乙烯信号转导途径上起着负调控的作用。通过双突变体分析，表明 乙烯受体的上位性基因，即 于乙烯受体的下游（ et 1993）。 基端与 酶类似，而且激酶活性为其功能所必须，或许表明 为 联反应起作用（谢 芳，2007）。 乙烯反应的负向调节因子，在乙烯受体的下游发生作用 (et 1998; et 2003; et 2008)。 因已经被克隆，据推测它编码了一个丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 (1993)。 兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 植物生长素原初反应基因包括 3 个主要类别 ， 分别是 1998; 2002)。 因 属于 因家族 ， 是 茉莉酸 生长素信号途径中的一个重要成员 , 它能够以 底物进行 同时它还参与了 导的植物防卫反应 (et 1998)。 1994 年 筛选获得了对 植物毒素冠菌素（ 敏感的拟南芥突变体 （ , et 1994）， 白是茉莉素信号转导途径中的关键调控因子，该蛋白的缺失突变能够导致植物丧失所有重要的茉莉素反应（ 闫健斌， 2010）。 所有 变体都对茉莉酸甲 酯不敏感， 表现为雄性不育 ， 易感病虫害，而且失去了对茉莉素的正常反应，如茉莉素诱导的基因表达，茉莉素诱导的花青素积累和侧根形成等 （陈 艳，任春梅， 2011） 。 点的下游对 径进行负调控。 码了一个茉莉酸敏感缺陷基因， 变体是雄性不育的，对甲基化茉莉酸的生长抑制作用没有反应，不能表达茉莉酸调节基因，对坏死营养的病原微生物表现出很强的感病性。 参与 信号原件之一，是多个 R 基因激发抗病信号的一个必须基因。 功能定位于产生活性氧中间体（ 游，植物发生超敏反应 (前（ 2001； 1996； ， 2000） 。0个氨基酸的锌指结构 (et 1999)。 值得注意的是， 植物中和 接互作。 植物防卫反应中可以通过降解靶蛋白调节 R 基因信号。 白也包含一个 域，这个区域是 结合位点 (2002)。 能与 结合，在不同的多蛋白复合体的组装和构象调节中起到伴侣的作用 (2002)。植物的 号传导体的亚基相联系。 基因介导的植物天然免疫反应中重要的信号分子。 因在 扰 技术 扰 et 2001)侵染或者阻止转座子元件的随机整合中发现的。 体的形成 。 小 成熟是由 异的核糖核酸酶 内源核酸内切酶催化的一个分段式过程，这种核酸内切酶被称为 包含了核糖核酸酶 及 合的区域。 体形成所兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 必需的，但不是长 成所必需的。 翻译成长的转录子，首先由细胞核内的 工 (2002; et 2003)， 然后由核向外运输受体输到细胞质 ( 2004)。当 运送到细胞质以后，将由 一步加工 (2001)，产生 21 个核苷酸长度反向互补的2001)。 在拟南芥中发现了四种类似 白（ 其中三种参与了不同来源的 加工 (et 2004)。 工 体，需要两种蛋白来完成： et 2003; et 2004; 2004)。植物病毒 产生需要 同参与了 形成。 默效应子复合物的组装 。含有反向互补构造 核蛋白粒子（ 后被整合到 导沉默复合体（ (2000)。 有一个单链 有 效应子复合体通常被称作 含有 效应子复合物通常被称作 et 2002)。任何一个 者 包含 白家族的一个成员， 结合。 组装依赖 2004; 2001)，这反映了 合物和 预组装的 象、组成发生变化时需要 合物中的单链 一个 白紧密结合：在亲和纯化 ， 不能影响小 白的结合 (2004)。 白的分子量大约为 100含两个保守的区域： 2002)。 白的 域和 H 家族的一些成员非常相似 (2004)，由于 H 切割 合物中的 ，所以 白应该切割 合体靶标中的目标 剪切和翻译抑制 。 的单链 以引导与其序列特异互补或者接近互补的目标 降解 (2002; 2004)。目标 互补区域的中部进行剪切 (2001)。由导的剪切反应并不需要 2001)，在 多次剪切中要求被剪切的 物释放，如果有 参与， 效 率会更高(2002)。这可能说明 旋酶参与了反应，可以辅助 合物中释放，或者重新组合核酸内切酶进行另一轮的目的别。 核物催化靶标 酸二酯键水解，软化 5磷酸基和 3羟基 (2004)。这种水解反应是对临近 2羟基的亲核攻击和对一个 2,3环状磷酸酯中间产物软化产生的。靶标 水解反应需要镁离子的参与，与兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 体加工成 发生的水解反应类似。 酸酶是一个亚基，是没有核酸内切酶活性的；因为作为一个微球菌核酸酶蛋白家族的一员，它应该产生 3磷酸基而不是 5磷酸基。 白自身可能是 以作为核酸酶。 调节子 。 默可以控制靶标基因下游基因的表达，但是自身也被调节。例如，在植物和线虫中，沉默信号在细胞间传递引起系统沉默，需要赖的 合酶（ 参与。 在很多生物中，由 导的 默是抵抗 毒和转座子元件的一种内在免疫反应 (2001; 2003)。在植物病毒和昆虫蜂窝病毒中发现了抵抗寄主免疫反应的防卫策略 (2002)。这些病毒可以表达抑制子，例如 合蛋白，它可以干扰寄主细胞的沉默机制。番茄矮丛缩病毒的 白已经和 21 个核苷酸的 合物共结晶出来，是一种病毒抑制子 (et 2003)。 白的同型二聚体和 糖 于 合物末端碱基对上方的两个 螺旋处。这种结合使 白可以区别 核物和 论 长的还是短的。病原物的其它 默抑制子把 作靶标，或者限制系统沉默信号从被侵染的细胞向外传播。 原料产生 是它和腺苷酸脱氨基酶（ 化的 成过程相竞争，这个过程将腺苷酸转化为次黄嘌呤。这种合成反应不仅使 靶标 再具有互补性，而且使 能很好的作为 原料 (2002)。在线虫基因筛选过程中，发现了另一个 个调节子含有核酸外切酶区域。 神经 元中特异表达，丧失该蛋白功能的突变体神经元中 扰增强。生物化学分析表明， 好的底物。 植物抗病毒防卫反应中的作用 在植物中， 默以两种方式减少病毒的积累。第一种方式是限制病毒最初侵染细胞中的积累。这种方式是通过将病毒 工成病毒成的，通常用来降解外源病毒分子。第二种方式通过产生系统沉默信号并按照病毒传播的路径传播，使距离较远的组织产生迅速的抗病毒反应。第一种情况称为恢复，植物不表现病毒病症状。第二种情况称为植物 作用，植物表现出明显的病害症状，病毒在植物中积累。 鉴定基因功能中的应用 为了验证某些基因在特定反应中的功能，科研人员通常选择基因敲除的方兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 式。通过技术手段使候选基因不表达，通过观察植物表型，或者观察植物和病原物之间的反应，来确定这些基因的功能。 基因敲除的一种有效手段。 首先克隆目的基因片段，并在目的片段两端加上相应的酶切位点，分别将目的基因正向和反向连入植物表达载体。将构建好的植物表达载体转化农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化，将含有正向和反向目的基因的片段整合到植物的基 因组中，人为的在植物体内形成与候选基因 补的 些 异的切割候选基因的 以达到沉默目的基因的目的。 物抗烟草花叶病毒的研究进展 迄今为止，从不同的寄主植物中，已分离 并 鉴定了 近百 个 抗病 基因，分别对线虫、真菌、细菌等不同的病原物表现抗性 。 其中，包括十余个抗病毒 R 基因，分别识别 不同植物病毒的 因 （表 。 表 已报道植物抗病毒基因 抗病 基因 植物 R 基因 结构 病毒 因 参考文献 N 烟草 属（ et 1994 N 林烟草（ s） 2012 铃薯（ S. 999 铃 薯 （ S. 2000 南芥 2000 南芥 态型（ A 24） et 2002 茄属（ et 2001 兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 铃薯 （ S. ? 002 茄属（ p.） 003. 物抗烟草花叶病毒的基因 N 基因。 烟草的 N 基因和烟草花叶病毒的互作是研究最早、最充分的一个植物病原物互作模型。 1914 年， 现心叶烟 （ 在受到烟草花叶病毒侵染的时候会产生坏死斑。随后， 经典的遗传学实验中证明 N. 受到烟草花叶病毒的侵染后，它的一个显性基因控制了坏死反应的发生。虽然当时 N 基因还没有被鉴定，但仍然在研究烟草花叶病毒中起到了很大的作用。起初，含有 N 基因的植物被用来估测病毒的相对数量，因为这些植物中坏死斑的数量和病毒的数量成正比。 烟草 N 基因可以对 生抗性 (et 1994)。当含有 N 基因的烟草受到烟草花叶病毒侵染后， 48 小时内会在侵染部位产生超敏反应，将病毒限制在坏死病斑周围的一个小范围区域内 (1934)。用烟草花叶病毒侵染不含 N 基因的烟 草时，烟草花叶病毒会在这些烟草中无限制的传播，引起明暗交替的花叶症状。 1931) 第一个观察到 N 基因介导的 赖于温度。当温度在 28以下，受到 染的含有 N 基因的烟草会产生 而，当温度在 28以上，含有 N 基因烟草将会丧失产生 能力， 系统传播。 N 基因功能的丧失是可以逆转的，当植物被放回 28以下的环境中时， 能将会恢复。如果烟草在比较高的温度下被系统侵染后转移到比较低的温度环境中，烟草将会因为致命的系统 死亡。 N 基因是通过插入玉米转座子的方法分离得到的 (1994)，主要依据是 N 基因介导的对 抗性是对温度敏感并且可逆转。通过交替剪切，N 基因编码两个转录产物 N 基因的全长编码 由于位于 N 基因内含子 部的一个 70代外显子交替剪接形成。这两个产物是 N 基因产生烟草花叶病毒抗性必不可少的。 对 N 基因结构进行功能分析发现： 个区域对 N 基因功能的发挥都是必不可少的。 N 基因主要由烟草花叶病毒复制蛋白 C 端螺旋区域激活，即 制蛋白的 50旋区域，诱导 寄主发生超敏反应，限制病毒在兰州大学硕士研究生学位论文 林烟草抗烟草花叶病毒 ( 基因的信号传导途径研究 体内进一步传播。 因在 N 基因介导的 性的信号转导途径中扮演着重要的角色 (2002)。本氏烟的 大麦 （ 的 接互作 (et 2002; et 2002)。 白是一个高度保守的真核蛋白，它和参与蛋白质降解的 蛋白连接酶相联系 (999)。基因沉默实验表明： N 基因功 能的发挥中都是必不可少的。在烟草和大麦中， 另外一个多蛋白复合体 联系， 与了蛋白质的降解 (et 2002)。如果抑制 组成分子 号小体的两个亚小体，可以导致 N 基因对烟草花叶病毒的抗性丧失。在 沉默的植物中， N 基因介导的植物抗性将会丧失 (et 2004)。在 N 基因介导的烟草花叶病毒抗性中，两个线粒体激活蛋白激酶（ 受伤诱导蛋白激酶（ 水杨酸诱导蛋白激酶（ 激活。 信号分子水杨酸（ 茉莉酸（ 乙烯在植物的防卫反应中有重要的作用。在表达水杨酸羟化酶的转基因植物中， N 基因介导的对烟草花叶病毒的抗性被克服，因为这种转基因植物不能积累 et 1994)。当含有 间积累 (et 2001)。 N基因。 一种野生烟草，俗名林烟草、南美烟草，原产于南美。 N. 植物界，被子植物门，双子叶植物纲，茄目，茄科，烟草属。林烟草的花呈管状、白色，在叶子上 呈簇状生长；花长 7 厘米，宽 2厘米，每朵花都会结出大量的小种子 （ et 1976）。 N基因来源于 林烟草 ( N基因全长 4143 个碱基对，共编码 1380个氨基酸，属于 蛋白 (et 2012)。 N基因 可以诱导植物对 多数菌株产生 是， 系除外，这些菌株可以在含有N基因的植物里可以系统传播并且引起花叶症状。 壳蛋白基因的点突变可以诱导含有 N基因的植物产生超敏反应。目前已经发现 能 引 起 超敏 反应 壳蛋白 的突变位点有四个，即 11 位、 20 位、25 位和 46 位，分别将 变为 变为 变为 et 1989)。 烟草花叶病毒的转基因植物育种 目前 对烟草花叶病毒的防治主要集中在化学农药防治和植物 自身 化合物防治方面，通过转基因手段培育抗病烟草品种比较少，主要 是 将烟草花叶病毒外壳蛋白导入烟草 以 培育抗病品种。 1929 年 ， 次 报道了交叉保护现