【毕业学位论文】（Word原稿）水稻苗穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定植物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 水稻苗 /穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定 .) .) I 摘 要 水稻对稻瘟病的抗性存在较大的差异，一些品种不但具有广谱抗性且具有全生育期抗性，而另一些品种不但 对不同病原菌小种的抗性反应不同，而且不同生育期对同一病原菌小种的抗性反应也不同。为了探讨小种特异抗性和生育期特异抗性的分子基础，第一，选用穗期对稻瘟病抗 /感反应 差异的一对水稻品系，利用抑制消减杂交 （ ，分离水稻对穗瘟防卫反应相关基因；第二，选用一个具有小种特异抗性的水稻品种，分离水稻 亲和互作中差异表达的基因，并对筛选到的差异表达基因在不同生育期的表达进行了 析。 为了进一步研究差异表达基因的功能，还构建了水稻抗稻瘟病苗期和穗期两个全长 库。 选用遗传背景相近、对叶瘟抗 性相同但对穗瘟抗性不同的两个水稻株系 ， 利用 建穗瘟抗 /感消减 库，经差异筛选及序列分析，共获得 90 个独立的差异表达 隆。利用析了 26 个所筛选到的 隆在抗 /感植株接种后的表达， 17 个基因的表达差异得到验证。 对这些 基因在穗期抗 /感植株中接种 稻瘟菌 后的表达谱进行 析，它们在抗 /感植株中受稻瘟菌感染后 或 被诱导或被抑制，但 在 抗 /感植株中被诱导 和 被抑制所发生的时间以及程度 不同 。 推测 号传导途径在水稻防卫穗瘟过程中起着重要的调节作用， 以同一水稻品种中 156 接种 不同稻瘟菌 小种， 通过 建水稻 亲和互作消减 库，结合差异筛选，经序列 测定 及 析 ，共获得 25 个独立的 经验证的 差异表达 隆， 并对它们在苗期水稻 亲和 /亲和互作早期的表达谱 进行了分析 ，被检测基因在非亲和 /亲和互作零点的表达水平相同，而在接种后 ，它们的表达发生变化，说明所有这些变化都是由于接种引起的；在两种不同的互作反应中，大部分基因 的表达 变化趋势一致，但存在程度的差异；少数基因表达变化在两种互作中不一致， 说明这些表达的变化仅仅与接种的不同小种有关，肯定 了所分离到的基因及其表达变化的可靠性。 部分基因 在穗期受 不同 稻瘟病菌 小种 侵染后也 发生变化 ，但变化趋势 与苗期有所 不同 。 信息学功能分析表明，苗期和穗期所筛选到的参与水稻稻瘟病防卫反应的基因，都涉及到 病原菌或 环境 胁迫应答、信号传导、转录、蛋白 合成与 修饰、代谢 、转座 等生物学 功能。 本研究表明，无论在穗期或苗期，还是寄主特异或小种特异抗性的防卫反应中，大多数参与水稻对稻瘟病防卫反应的基因在抗病和感病反应过程中都被诱导或被抑制，这些基因可能作为基础抗性基因参与到防卫反应过程中，但由于它们表达发生变化的时间和程度的差异而 导致了抗性反应的不同；而少数基因在抗 /感反应过程中受病原菌侵染后的表达变化趋势存在较大差异，甚至呈现完全相反的变化趋势，这些基因可能在抗病反应过程中起主要的调节作用。但苗期和穗期对稻瘟病的防卫反应存在一定的差异，因此推测，由于一些参与防卫反应的基因不但受病原菌小种的诱导，而且也受水稻本身生长发育的调节，从而产生了病原菌小种特异抗性和寄主生育期特异抗性。 关键词 ： 稻瘟菌， 穗 /叶 瘟 抗性 ，小种特异抗性，防卫反应相关基因 ， 抑制消减杂交，水稻 is a to in of of it be to to it to in in to at In to of to we to in by of in a to of of in SH in of 95/to by of 7 of 6 in of 6 at of or in or of in to of it is a in to be of of a 56 an a B1 of to SH in in of of 5 at of h of by or in of to of of in It is in of of of of 5 at to to at be or at of So we to in 56 be by of of to of in be in of or in of at as as in or in as in be of at of of A in in in in at of It be of by of of in to at .) 录 第一章 绪论 . 1 物抗病的分子生物学基础 . 1 物抗病基因的结构 . 1 蛋白的结构赋予了它的功能 . 4 基因与 因的互作 . 5 物抗病的特异性 . 7 原菌小种特异抗性的分子基础 . 7 谱抗性的分子基础 . 8 号传导相关因子的克隆及结构 . 9 物防卫反应相关基因 . 11 稻抗病性的分子机理研究进展 . 12 稻的抗病基因 . 12 稻的防卫反应相关基因 . 14 物基因克隆方法 . 16 制差减杂交技术的基本原理 . 16 制消减杂交法的特点 . 17 术在植物基因克隆中的应用 . 17 望 . 18 研究的背景和意义 . 19 第二章 水稻穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定 . 20 料方法 . 20 稻材料 . 20 瘟菌接种 . 21 取和 离 . 21 制消减杂交 . 22 SH 库的构建 . 23 减 库的差异筛选 . 23 序及序列相似性搜索 . 24 异表达克隆的 析 . 24 果 . 25 SH 库的构建 . 25 库的差异筛选与 源性分析 . 25 异表达 隆的功能分类 . 26 向和反向文库中差异表达克隆的比较 . 26 瘟抗感反应进程中 隆的 析 . 27 论 . 28 术和差异筛选 . 28 水稻抗稻瘟病研究中的应用 . 29 病和感病反应中差异表达基因的异同 . 29 V 稻穗瘟防卫反应相关基因的功能分析 . 30 稻穗瘟抗性过程中的 号传导途径 . 34 第三章 水稻对不同小种稻瘟菌抗性差异表达基因的鉴 定 . 43 料与方法 . 43 稻材料 . 43 瘟病菌的接种 . 43 制消减 库的构建和差异筛选 . 44 列测定及 源性分析 . 44 异表达基因的 析 . 44 果 . 45 减 库的构建和差异筛选 . 45 选的差异表达基因 索与功能分类 . 45 异表达基因在苗期非亲和 /亲和互作中的表达谱分析 . 45 选的基因在穗期受稻瘟病菌侵染后的表达谱分析 . 46 论 . 47 亲和 /亲和互作中的差异表达基因的筛选 . 47 期非亲和 /亲和互作中差异表达基因的表达 . 49 异表达基因在苗期和穗期 受稻瘟病菌侵染后的表达分析 . 50 第四章 水稻抗稻瘟病全长 库的构建 . 57 料方法 . 57 稻材料 与稻瘟病菌接种 . 57 长 库的构建 . 57 库质量的检测 . 59 菌体 变为质粒 . 60 粒 提取 . 61 库插入 小的分析 . 61 果 . 61 提取和 纯 化 . 61 合成及其分级分离 . 62 库的质量分析 . 62 论 . 62 参考文献 . 74 致谢 . 94 个人简历 . 945 图及附表清单 图 SH 库插入片段凝胶分析 . 40 图 于 差异筛选代表性结果 . 40 图 向和反向文库中差别表达克隆的功能类别百分比比较 . 41 图 分所选克隆在抗 /感植株接种稻瘟病菌后的 达 . 42 图 分所选到的克隆在抗 /感植株中的表达谱分析 . 43 图 分差异表达克隆在中 156 中苗期接种不同小种后的 达谱 . 55 图 分差异表达克隆在中 156 中穗期接种不同小种后的 达谱 . 56 图 醛变性凝胶电泳图谱 . 65 图 链 脂糖凝胶电泳图谱 链 酶切消化后的分级分离纯化电泳图谱 . 66 图 白斑筛选测定文库重组率中的一个平板 . . 66 图 库克隆 入片段的琼脂糖凝胶图谱 . 57 表 期抗 /感 库筛选与序列同源搜索结果 35 表 期筛选到的克隆及其功能注释 . 35 表 期抗 /感 库中重复筛选到的克隆 38 表 SH . 39 表 5 个小种特异抗性差异表达克隆的 物列表 . 51 表 稻 亲和互作中筛选到的差异表达基因 果 . 52 表 异表达基因在苗期和穗期接种稻瘟病菌小种 表达 . 54 表 156 苗期抗稻瘟病全长 库的质量检测结果 . 64 表 梅 2 号穗期抗稻瘟病全长 库的质量检测结果 . 64 第一章 绪论 1 第一章 绪论 植物抗病性及其 抗病 机制研究一直是植物病理学和植物抗病育种中的热点问题 ， 多年来，通过传统育种已成功培育出了许多抗病作物品种。 近年来， 分子生物学的发展为在分子水平上分析抗病机理成为可能，可以对植物防御和寄主 可以通过分子标记辅助选择等更先进的技术制定选育作物新品种的策略，为长期的作物改良提供了新的现代生物技术方法 。 在自然环境中，植物不断地受到病原菌微生物如真菌、细菌和病毒等的侵袭。在受到病原菌侵袭时，植株体内产生生理和生化变化来防御胁迫。 植物对外界病原菌的防御体系包括其自身固有的和病原菌诱导的两种。前者主要包括细胞壁的角质、蜡质、木质素、特殊的气孔结构、小分子抗病物质 (如毒性脂肪酸、酚类化合物、类萜与类黄酮类植保素以及有关的过氧化物酶、多酚氧化酶与苯丙氨酸解氨酶等 )、种子固有的抗真菌蛋白和能与真菌几丁质结合的凝集素、破坏真菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等 (王钧， 1998)。而后一类属于植物第二层防御体系，只有 当病原菌突破植物固有的第一道防线时才起作用。 如果寄主植物具有抗病基因（ 能够识别病原菌并激活植物的防御反应，则表现出局部或系统抗性 （ et 1996）。只有在先天防御不充分，或不能有效识别病原菌，或防御反应软弱无效，且环境适宜等条件下，植物表现出感病。植物 抗病 基因与病原菌无毒基因（ 物 之 间直接或间接互作导致产生的 “基因 基因 ”的抗性是植物抗病性的 主 要形式 (1