蛋白质工程重点

一 名词解释一 名词解释 1 蛋白质工程 蛋白质工程 Protein Engineering 以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的 关系作为基础 通过化学 物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成 对现 有蛋白质进行改造 或制造一种新的蛋白质 以满足人类对生产和生活的需求的工程 技术 2 结构模体 结构模体 supersecondary structure motif 介于蛋白质二级结构和三级结 构之间的空间结构 指相邻的二级结构单元组合在一起 彼此相互作用 排列形成规则 的 在空间结构上能够辨认的二级结构组合体 并充当三级结构的构件 block building 其基本形式有 和 等 3 结构域 结构域 domain 是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部 折叠区 它是相对独立的紧密球状实体 4 蛋白质的折叠 蛋白质的折叠 protein folding 从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一 维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程 5 分子伴侣 分子伴侣 molecular chaperone 一一大类相互之间没有关系的蛋白质 它们 具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装 但不是 这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分 6 晶胞晶胞 Unit cell l 空间点阵的单位 大小和形状完全相同的平行六面体 是晶 体结构的最小单位 7 核磁共振现象 核磁共振现象 nuclear magnetic resonance NMR 指核磁矩不为零的核 在外磁场的作用下 核自旋能级发生塞曼分裂 Zeeman splitting 共振吸收某一特定频 率的射频辐射 radio frequency RF 的物理过程 8 化学势 位 移化学势 位 移 在有机化合物中 各种氢核周围的电子云密度不同 结构中不同位置 共振频率有差异 即引起共振吸收峰的位移 这种现象称为化学 位移 9 耦合常数耦合常数 J 由于自旋裂分形成的多重峰中相邻 2 峰间的距离 用以表征 2 核之间耦合作用的大小 单位赫兹 Hz 10 蛋白质组 蛋白质组 proteome 一个基因组 一种生物或一种细胞 组织所表达的全 套蛋白质 二 问答题二 问答题 1 蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法 蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法 随机突变 UV X 射线 其他化学方法 转座元件 简并引物 定点突变 核式突变 限制性内切酶位点 寡核苷酸介导突变 PCR 依赖 1 Kunkel 突变法 dut ung 双突变菌株添加突变引物 在不含 U 碱基的噬菌体内延伸引物 转染于 dut ung 野生型受体菌 不含 U 碱基的保留 含 U 碱基的被切除 原理 原理 当大肠杆菌 dUTP 酶缺失突变时 dut 这些细菌就不能把 dUTP 转化为 dUMP Mutan t U U U U Templ ate U U U U U U Templ ate U U Templ ate U U U U U U 因而细菌体内的 dUTP 浓度大为增加 并且一些 dUTP 会掺入到 DNA 合成中应该由胸腺 嘧啶占据的位置 而此时大肠杆菌体内还存在一种尿嘧啶 N 糖基化酶 它可以去除掺 入到 DNA 中的尿嘧啶残基 但在尿嘧啶 N 糖基化酶缺陷性菌株中 ung 由于该酶 的失活将不能把尿嘧啶从 DNA 链中剔除 使细菌 DNA 中一小部分胸腺嘧啶残基被尿嘧 啶所取代 在 dut ung F 菌株中 取代比例有所提高 由该菌株培养的 M13 噬菌体 的 DNA 中会含有 20 30 个尿嘧啶残基 用这些噬菌体转染 ung 菌株 尿嘧啶被除去 并因此产生一些可阻断 DNA 合成且对特定核酸酶敏感的位点 病毒 DNA 被破坏 感染 力下降约 5 个数量级 Kunkel 突变法正是利用上述机制 首先在 dut ung 的双突变菌株中培养适当的 重组 M13 噬菌体 制备出带 U 的单链 DNA 模板 然后与突变引物退火 引物延伸 然 后将延伸反应混合物转染 ung 受体菌 模板链因由 U 碱基位点的存在而被破坏 野生 型噬菌体的产生受到抑制 大部分 80 的后代噬菌体是由所转染的不带 U 的负链 复制而来的 由于该链是由突变引物延伸而来的 因此 后代噬菌体多带有突变的目 标基因 所以 Kunkel 突变法所产生的突变体不需要利用标记的寡核苷酸探针来筛选 阳性噬菌斑 可直接通过序列分析来确定突变体 2 2 DpnIDpnI 法进行定点突变法进行定点突变 常规大肠杆菌中质粒含 Dpn 位点 添加一对正反向突变引物 体外退火延伸 模板质粒对 Dpn 酶敏感 被切除 体外合成的突变序列质粒成功转化 原理 原理 一对包含突变位点的引物 正 反向 和模版质粒退火后用PfuTurbo 聚 合酶 循环延伸 所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物 一圈后回到引 物 5 端终止 再经过反复加热褪火延伸的循环 这个反应区别于滚环扩增 不会形 成多个串联拷贝 正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒 DpnI 酶切延伸产物 由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌 是经dam 甲基 化修饰的 对 DpnI 敏感而被切碎 DpnI 识别序列为甲基化的 GATC GATC 在 几乎各种质粒中都会出现 而且不止一次 而体外合成的带突变序列的质粒由于 没有甲基化而不被切开 因此在随后的转化中得以成功转化 即可得到突变质粒的 克隆 2 重重叠叠延延伸伸 PCR 4 个个引引物物 技技术术 正向引物 反向引物 第一轮PCR 共有4种产物 引物退火变性延伸 只能5 3 方向聚合 用DNA聚合酶扩增至完整链 第二轮PCR 用两端引物扩增目的基因 原理 原理 由于采用具有互补末端的引物 使PCR产物形成了重叠链 从而在随后的扩增反应 中通过重叠链的延伸 将不同来源的扩增片段重叠拼接起来 此技术利用PCR技术能够在 体外进行有效的基因重组 而且不需要内切酶消化和连接酶处理 可利用这一技术很快获 得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物 3 蛋白质结构测定方法的优缺点 蛋白质结构测定方法的优缺点 1 蛋白质结构测定方法 X射线晶体结构测定 核磁共振波谱法 NMR 三维电 镜重构 2 X射线晶体结构测定 射线晶体结构测定 优点 分辨率高 不损伤样品 无污染 相对快捷 能得到晶体完整性的大量信息 SP6 primer Reverse mutagenic primer T7 primer Forward mutagenic primer First PCR Remove primers Denature and anneal 3 3 Extend to full length by DNA polymerase Second PCRSP6 primer T7 primer DNA cloning 缺点 晶体构象是静态的 不能测定不稳定的过渡态的构象 很多蛋白质很难结晶 或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶 瓶 颈 X射线晶体衍射的工作流程较长 核磁共振波谱法 核磁共振波谱法 NMR 优点 同样具有高分辨率 可以在溶液中操作 接近生理状态 分析并直接模拟出蛋白质的空间结构 蛋白质与辅基和底物结合的情况以 及酶催化的动态机理 缺点 样品的分子量要比较小 50KD以下 对不溶的蛋白比较困难 如膜蛋白 实验周期长 1年 三维电镜重构 三维电镜重构 优点 1 可以直接获得分子的形貌信息 2 适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品 如 难以结晶的膜蛋白 大分子复合体等 3 适于捕捉动态结构变化信息 4 易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息 5 电镜图像中包含相位信息 所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方 便 缺点 最大的缺点是分辨率较低 对小分子蛋白效果不佳 4 X射线晶体结构测定原理 步骤及优缺点射线晶体结构测定原理 步骤及优缺点 1 原理 1 光的衍射现象 2 X射线的发现及应用 3 晶体学基础知识 4 X射线晶体衍射 光的衍射现象 衍射现象 光波偏离直线传播而出现光强不均匀衍射现象 光波偏离直线传播而出现光强不均匀 分布的现象分布的现象 X射线的发现及应用 本质的争论 波动说 微粒说 X射线衍射的发现 晶体学基础知识 X射线晶体衍射 2 X射线晶体结构测定基本过程 蛋白质获取 提纯 晶体生长并经冷冻技术处理 重原子衍生物制备 衍射数据收集 衍生数据分析和改进 结构模型的获取 包括修正 3 优缺点 优点 分辨率高 不损伤样品 无污染 相对快捷 能得到晶体完整 性的大量信息 缺点 晶体构象是静态的 不能测定不稳定的过渡态的构象 很多蛋白质很难结晶 或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶 X射线晶体衍射的工作流程较长 三 简答题 有些没听到 1 空间结构组件及其特点空间结构组件及其特点 螺旋 helix 折叠 sheet 环肽链 loop 转角 turn 1 螺旋 结构 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转 形成螺旋结构 肽链内形成氢键 氢键的取向几乎与轴平行 同一方向 具有极性 N C 中心无空腔 稳定 蛋白质分子为右手 螺旋 选 选 螺旋一周 沿轴上升的距离即螺距为0 54nm 含3 6个氨基酸残基 两个氨基酸 之间的距离为0 15nm 沿主链计算 一个氢键闭合的环包含13个原子 3 613 螺旋一侧主要分布亲水 荷电 极性 残基 另一侧主要集中疏水残基 对生物活性具有重要作用 可用螺旋转轮 helical wheel 的方式预测两亲性 2 折叠 伸展的构象 每圈只有2个氨基酸残基的特殊螺旋 碳原子处于折叠的角上 R基团处于棱角上与棱角垂直 两个氨基酸之间的 轴心距为0 35nm 折叠片也是一种重复性的结构 可以把它想象为由折叠的条状纸片侧向并排 而成 肽主链沿纸条形成锯齿状 氢键是在片层间而不是片层内形成 折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面 并交替地从平面上下二侧伸出 3 转角 turn 回折 reverse turn 转折 转角 turn 转折 turn 发夹 发夹 hairpin 无规则卷曲 2 蛋白质的空间结构层次 蛋白质的空间结构层次 一级结构 二级结构 结构模体 结构域 三级结构 亚基 四级结构 3 第二遗传密码的定义及其特点 第二遗传密码的定义及其特点 定义 无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分 遗传密码的第二部 分 蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系 称之为第二遗传密码或折叠密 码 特点 简并性 氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构 多意性 相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构 全局性 在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用 并对分子总体结 构产生重要影响 后形成的肽段可以影响已经形成的肽段个构象从而造成对分 子整体的影响等 4 表达系统宿主的选择 表达系统宿主的选择 体内翻译系统 体外翻译系统 原核生物表达系统 大肠杆菌 枯草杆菌 真核生物表达系统 酵母表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物 细胞表达系统 5 大肠杆菌表达载体的组件 大肠杆菌表达载体的组件 复制起始点 选择性基因 多克隆位点 MCS 启动子 Promoter 终止子 Terminator 核糖体结合位点 SD序列 四 其他四 其他 一 一 蛋白质工程绪论 蛋白质工程绪论 1 蛋白质工程化的顺序 工程化 理念 设计 制造 功能实现 2 基因工程和蛋白质工程 选 选 基因工程蛋白质工程 相同点都要改造基因 都属于分子水平 产生的基因 型 无新基因 型 有新基因 型 产生的蛋白质原有的新的 联系蛋白质工程以基因工程为基础 是基因工程的应用和延伸 3 酶工程与蛋白质工程的区别 酶工程 酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备 蛋白质工程 重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造 4 蛋白质工程产生的标志 研究内容 支撑技术 1 1983年 美国的Ulmer在 Science 上首先提出了 Protein Engineering 蛋 白质工程诞生 Science 219 666 671 2 1 蛋白质结构分析 基础 2 结构 功能的设计和预测 基础的应用与验证 3 创造和 或改造蛋白质 新蛋白质 终目标 3 蛋白质结构解析技术 生物信息学分析技术 定点突变等遗传操作技术 二 蛋白质结构基础蛋白质结构基础 5 氨基酸的构型与构象及多肽链构象的表征参数 构型configuration 一个分子中原子的特定空间排布 L 型的单一手性分子 构型转化时必须有共价键的断裂和重新形成 不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重合 化学上可以分离 不可由单键旋转相互转换 构象conformation 组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布 构象转化时不需要共价键的断裂和重新形成 化学上难以区分和分离 表征参数 1 多肽链的构象角 2 拉氏构象图 Ramachandra plot 及多肽链构象的允许区 6 可用螺旋转轮 helical wheel 的方式预测两亲性 7 折叠的几种形式 平行型 反平行型 混合型 选 选 8 蛋白质的一级结构 多肽链中氨基酸的排列顺序 二硫键的数目和排列方式 9 维系蛋白质结构的作用力 肽键 二硫键 氢键 离子键 疏水键 范德华力 维持蛋白质一级结构的作用力是 肽 键 二硫键 三 三 蛋白质折叠 蛋白质折叠 10 20世纪60年代 Anfinsen基于还原变性的牛胰RNase在不需其他任何物质帮助下 仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然结构的实验结果 提出了 多肽链的氨基酸 序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息 的 自组装学说 证 明了一级结构决定高级结构 Anfinsen的贡献 氨基酸序列决定空间结构 蛋白质折叠的热力学 第一个发现了二硫键异构酶 亲和层析纯化蛋白 合成葡萄杆菌核酸酶 固相合成 11 体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的区别 完整肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠 与新生肽链的合成延伸 与折叠同时进行的不同 细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程 温度 浓度 pH值不同 细胞和试管另一个重要差别是 大分子拥挤 问题 12 帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子 分子伴侣 molecular chaperone 折叠酶 催化与折叠直接有关的化学反应的酶 蛋白质二硫键异构酶 PDI 肽基脯氨酰顺反异构酶 PPI 13 分子伴侣与酶的异同点及作用机制 1 分子伴侣与酶的异同点 相同点 参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现 不同点 分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性 分子伴侣的催化效率很低 分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠 2 作用机制 识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然结构 与这些中间物结合 生 成复合物 防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径 抑制不可逆的聚合物的产生 促进折叠向正确的有效的途径进行 分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象 而不会 去理会天然构象 分子伴侣与早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合 一旦聚合 形成 分子伴侣就无能为力了 14 蛋白质的质量控制系统 选 选 蛋白质是生物体内一切功能的执行者 蛋白质的错误折叠可以导致一些疾病 为保证细胞的正常活动 细胞通过各种层次的 质量控制 来识别 纠正和防止 错误的发生 15 折叠病与构象病的区别 选 选 分子病 由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾 病的情况 如地中海镰刀状红血球贫血症 分子病不是构象病 折叠病 蛋白质分子的氨基酸序列没有改变 只是其结构或者说构象有所改变 引起的疾病 四 四 蛋白质的理化性质 蛋白质的理化性质 16 蛋白质的理化性质 1 蛋白质折叠过程中会打破水的有序化 则 S溶剂为较大的正值 因而有利于折叠态 2 对于典型的蛋白质来说 对折叠结构的稳定性做出单项最大贡献的是疏水残基 引起的 S溶剂 3 蛋白质的稳定性主要指蛋白质的物理上 热力学 的稳定性 而不是化学稳 定性 4 与蛋白质折叠相关的焓有两个 通过平衡常数算得的Van t Hoff 焓 DHVH 通过量热法获得的量热焓 DHcal 如果DHVH DHcal 表明在 Tm处没有中间体的存在 系统属于两态转变 五 五 蛋白质分子模拟与设计 蛋白质分子模拟与设计 17 设计层次 分类 小改 定位突变和化学修饰 中改 结构域进行拼接组装 全新蛋白质设计 大改 完全从头设计全新的蛋白质 基于某些理论和研究结果 设计出初始分子模型 设计循环 18 蛋白质设计的目标及解决办法 设计目标 解决办法 热稳定性 对氧化的稳定性 引入二硫桥 增加内氢键数目 改善内疏水堆积 增加表面盐桥 把Cys转换为Ala或Ser 把Met转换为Gln Val Ile或Leu 把Trp转换为Phe或Tyr 19 甘氨酸 脯氨酸 丙氨酸的构象特征 分子量都比较小 灵活性 Gly Ala Pro 甘氨酸具有高度柔韧性 可在 螺旋 折叠处出现 但更常见于铰链区或 转角 Gly在定点突变时 一般不宜随意改变 Pro比较刚性 常出现在 转角 Ala处于二者之间 常用作取代别的氨基酸的首选 20 Janus 真正符合Paracelsus挑战的蛋白 六 六 蛋白质修饰 蛋白质修饰 21 基因融合与基因连接的方法及用途 方法 通过限制性内切酶 通过无义突变产生的限制性内切酶 重叠延伸PCR 用途 1 单分子活性组合 2 检测和提纯 3 提高基因表达量和增溶作用 4 细胞定位 22 非天然氨基酸的引入方法 tRNA介导的蛋白质工程 1 在体内引入氨基酸类似物 2 氨酰化tRNA半合成酶介导体内外翻译 3 非天然氨基酸tRNA合成酶 tRNA对介导的蛋白质工程 复制起始点 选择性基因 多克隆位点 启动子 终止子 核糖体结合位点 七 七 蛋白质的分离纯化与鉴定 蛋白质的分离纯化与鉴定 23 与蛋白质分离纯化相关的理化特性 蛋白质的溶解特性 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 蛋白质的分子大小 透析 超滤 凝胶过滤 离心 蛋白质的带电特性 电泳 离子交换层析 蛋白质的吸附性质 蛋白质与配体特异性结合不同 免疫亲和层析 生物亲和层析 金属螯合亲和 层析 拟生物亲和层析 蛋白质的分子形状 蛋白质的变性和复性 24 蛋白质纯化的总原则和纯化步骤 总原则 以合理的效率 速度 收率和纯度 将目标蛋白从细胞的全部其他成分 特别是不想要的杂蛋白中分离出来 同时仍保留其生物学活性和化学完 整性 步骤 选择实验材料 实验材料预处理 蛋白质的提取 蛋白质的粗分级 蛋白质的细分级 蛋白质的鉴定 25 蛋白质的粗分级 细分级方法 粗分级 1 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后 蛋白提取液中目标蛋白质的浓 度往往较低 采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩 同时去除大量的 杂质 这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级 2 硫酸铵分级沉淀 有机溶剂分级沉淀 超速离心 等电点沉淀 透析 超过滤 蛋白质结晶等 细分级 1 粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化 多数情况下还要根据蛋 白质分子大小 分子形状 分子表面特征或分子带电状况进一步纯化 这就是蛋白质细分级 2 常用技术 层析 分子筛层析 离子交换层析 疏水作用层析 亲和层 析 羟基磷灰石层析 和电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 等电聚焦电泳 IEF 双向电泳 26 不连续PAGE分离蛋白质的原理 选 电荷效应 浓缩效应 快慢离子效应 凝胶浓度差效应 分子筛效应 27 镍离子层析方法属于亲和层析 八 八 蛋白质结构测定 蛋白质结构测定 28 Western Blot基本原理与步骤 基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体 然后用这 种多肽的特异抗体来检测 一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 抗原抗体显色反应 具体步 骤 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 29 晶体的初步鉴定 选 选 小分子晶体蛋白质晶体 边界完整 漂亮常不完整 易出现多晶 硬度偏硬 易碎成2瓣或几瓣 偏软 易碎成粉 脱水不变化因脱水而变坏 溶解性慢快 偏光性强相对弱 染色性弱强 漂浮性下沉漂浮 30 共振条件 1 核有自旋 磁性核 2 外磁场 能级裂分 3 照射频率与外磁场的比值 0 H0 2 外加射场的频率与原子核自旋进动的频率相同 31 电子显微技术的最大缺点是分辨率较低 谱图中化合物的结构信息 1 峰的位移 每类质子所处的化学环境 化合物中位置 2 峰的裂分数 相邻碳原子上质子数 3 偶合常数 J 确定化合物构型 4 峰的数目 标志分子中磁不等性质子的种类 多少种 5 峰的强度 面积 每类质子的数目 相对 多少个 不足之处 仅能确定质子 氢谱 九 九 蛋白质组学 蛋白质组学 32 HPP里程碑 两谱 蛋白表达谱 修饰谱 两图 蛋白连锁图 亚细胞定位图 三库 样本库 抗体库 数据库 33 蛋白质组研究整体技术的特点 规模化 通量化 自动化 技术目标 要求 有效分离 准确鉴定 合理分析 34 蛋白质组学研究的手段 蛋白质组研究的核心 用于分离的双向电泳 2 DE 蛋白质组技术的支柱 鉴定技术 Identification 蛋白质组研究的百科全书 数据库 database 35 生物质谱技术 原理 将样品离子化 根据不同的质量和电荷差 异确定分子量的技术 应用 蛋白质序列分析 蛋白质修饰分析 最重要的鉴