Y遗传性疾病基因治疗的进展

遗传性疾病基因治疗进展,安徽医科大学第一附属医院 小儿神经康复中心The 1st affiliated hospital of AHMU Neurological rehabilitation center of pediatrics department,唐久来 教授,定义,遗传性疾病（hereditary / inherited / genetic disease）简称遗传病，是指生殖细胞或受精卵的遗传物质（染色体和基因）发生突变（或畸变）所引起的疾病。,遗传性疾病的分类,遗传病目前有6000多种，一般分为：基因病（genic disease） 单基因病 （monogenic disease） 单基因病可按遗传方式而再分类 。 多基因病（polygenic disease）。染色体病（chromosomal disease）。 常染色体异常、性染色体异常。,遗传性疾病的发病率,基因病单基因病 2.5 常染色体显性遗传病 0.9 常染色体隐性遗传病 1.3 性连锁遗传病 (脆性X综合症） 0.3 多基因病 18.0 染色体病 0.54 常染色体异常 0.36 性染色体异常 0.182 ,遗传性疾病的病因病理,疾病基因基因突变染色体畸变 父母遗传、环境因素（孕母年龄、宫内病毒 感染、放射线及化学因素）,遗传性疾病的诊断,主要根据典型的临床表现及实验室诊断，实验室诊断主要染色体检查和基因诊断。基因诊断对疾病的机理、治疗和新药的研发都具有划时代的意义。,基因诊断的意义(治疗和研发新药),最近，英国科学家发现引起肥胖的相关基因，该基因使人体更易过多吸收脂肪而导致肥胖症、糖尿病、高血压和心脏病。进而研发新的治疗药物。他们发现3种罕见疾病病因都与人体过多吸收脂肪有关。第一种病叫乳糜微粒血症，第二种病是糖源储积病四型，又名安德森病，第三种病是另一类乳糜微粒血症。,这3种疾病都与人体代谢功能失调有关。一种叫Sar1b的蛋白在吸收食物脂肪时出现功能失调。他们对来自全球的一些病例进行了比较研究，发现3种疾病所有患者都有相同遗传基因变异。帝国理工学院的专家说，今后的研究将集中在Sar1b蛋白的遗传基因类型方面。这项研究可能对了解肥胖症的病因和治疗提供重要线索。,遗传病的治疗,遗传病的治疗是对遗传病患者采取一定的方法以纠正或改善机体病理性状态的医学措施，从基因缺陷到出现临床表现，涉及到很多病理变化过程，每一病理过程都可能成为遗传病治疗的着眼点。,染色体病的治疗,染色体病不仅没有办法根治，改善症状也很困难，个别性染色体异常，如Klinefelter综合征早期使用睾酮， X染色体畸变引起疾病的女性患者，可以补充雌激素，使患者的第二性征得到发育也可改善患者的体格发育；真两性畸形进行外科手术等有助于症状改善。,基因病的治疗,由于多基因病的发病中环境因素起着重要的作用，故对药物治疗有较肯定的疗效；而单基因病的药物极少有效，且疗效不肯定，如分子病和酶病的治疗目前只能针对不同的发病环节，采取措施，可收到一定的效果，有些还只能达到在一定时期内改善症状的目的，根本的方法只有等待基因治疗。,遗传基因病治疗的治疗有与一般疾病相同或相似的方法，也有它治疗本身所特有的方法。近年来，随着重组DNA技术在医学中的广泛应用，遗传病的治疗有了长足的进步，已从传统的内科治疗（饮食疗法、药物疗法、放射疗法、康复疗法）、外科治疗等发展到基因治疗。,基因治疗,针对遗传病患者缺陷的基因而实施的治疗称为基因治疗(gene therapy).基因治疗是治疗遗传病的理想方法，只有纠正了致病基因才能达到根治的目的。现代基因工程技术的发展，使基因治疗成为可能，给遗传病治疗带来了新的希望。,基因治疗(gene therapy)是指应用基因工程技术，更换、校正或增补缺陷基因，以达到治疗遗传病的目的。基因治疗也可以理解为将正常的有功能的基因转移到患者体内发挥功能，以纠正患者体内所缺乏的蛋白质或赋予机体新的功能。早在1989年，美国科学家罗森博格(Roseberg)等对5名恶性黑色素瘤患者进行了标志基因转移人体的首次临床实验，表明体内基因转移对人体没有伤害。1990年11月布莱斯(Blease)等成功进行了世界首例腺苷脱氢酶(ADA)缺乏症患者的基因治疗。,迄今为止已有近几十种遗传病被列为基因治疗的主要对象，如ADA缺乏症、PNP免疫缺乏症、囊性纤维瘤(CF) 、血友病、血红蛋白病等，其中ADA基因缺乏所致的SEID病、CFIR基因缺乏所致的CF疾病、LDLR基因缺乏所致的家族性高胆固醇血症、凝血因子缺乏所致的血友病B、葡萄糖脑苷脂酶基因(GO)缺乏所致的GD疾病等疾病研究已经进入了临床试验阶段，取得了不同程度的成功,基因治疗的步骤包括目的基因的克隆、目的基因的转移、目的基因的表达、靶细胞的选择和安全性问题等。靶细胞的选择根据所治疗的遗传病而定，大体可分为二类，即体细胞和生殖细胞体细胞基因治疗有在体转移和活体直接转移两种选径，目前开展的基因治疗均用体细胞作为靶细胞。遗传病中常用于基因治疗的靶细胞有骨髓造血干细胞、皮肤成纤维细胞、成肌细胞和肝细胞等。生殖细胞基因治疗因涉及敏感的伦理学问题，目前禁止仍人体试验。,目前常用的基因治疗常有 以下几种方法：,转基因治疗,是将正常的基因导入具有缺陷基因的细胞内，并整合到核DNA分子中，再表达相应的遗传信息，使原有的缺陷得到纠正，即传统的目前主要开展的基因治疗。这种方法在理论上可以纠正遗传性疾病，正在进行大量的动物实验，并越来越多地开展人体实验治疗。,基因修复,原位修复是最理想的选择，但目前尚很难做到，因为要在人类基因组的某个特意部位上进行重组是一个非常复杂的过程。即使在不太复杂的模式生物中进行基因定位重组也不容易实现。,基因开放,开放类似功能的基因，以超过或代替异常基因的表达。比如，通过去甲基化使已关闭的珠蛋白基因重新开放，合成HbF，以代替HbA用于治疗-地中海贫血症。,基因抑制,导入外源基因以抑制原有的基因， 目的在于阻断有害基因的表达。如向肿瘤细胞内导入P53等肿瘤抑制基因以抑制癌基因的异常表达。,基因封闭反义RNA能封闭mRNA，抑制基因的表达。免疫基因 将免疫因子（如肿瘤坏死因子、干扰素等）基因导入肿瘤浸润淋巴细胞(TIL), 用于提高细胞的免疫功能，加强TIL细胞杀伤肿瘤细胞的能力。,基因导入方法,把外源基因安全有效地转移到靶细胞中，是实现转基因治疗的第一个关键步骤。常用方法有： 注射法 电穿孔法 微粒子轰击法 化学法 载体介导转移法 同源重组法,注射法,注射法是将DNA或DNA-载体直接注射到肌肉及其他器官，使邻近的细胞摄入DNA并进行基因表达。 如通过肌肉注射将腺病毒运载的目的基因转移到骨骼肌细胞上治疗犬模型B型血友病获得满意效果。,电穿孔法,电穿孔法(electroporation) 将靶细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞。有用此法治疗犬和鼠模型血友病B型的报道。,化学法,化学法是应用磷酸钙沉淀法改变细胞膜的通透性，以加强细胞从培养液中摄取外源DNA。但此法转移效率低，其成功率约在1 100 11000。,载体介导转移法,病毒介导转移法质粒介导转移法脂质体介导转移法聚乙烯亚胺介导转移法,病毒介导转移法,病毒介导转移法(viral mediated gene transfer)是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体(viral vector)，通常使用的病毒运载体有腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体等。,以腺病毒为载体研究进行的囊性纤维变(cystic fibrosis，CF)转基因治疗在体外培养细胞中获得了成功，即转入的正常基因纠正了CF的缺陷。 而如何将基因导入这些细胞并回到其功能位置，则是一件十分棘手的事，目前有报道提示喷雾法导入病毒运载体避免了直接滴注法的许多不利因素，也优于一般雾化吸入。,其他如腺相关病毒介导转移法治疗鼠型粘多糖增多症模型，鼠A型血友病模型，鼠脑白质营养障碍模型等。 用逆转录病毒载体治疗鼠球状细胞白质营养障碍，都使其临床症状得到改善。,质粒介导转移法,质粒介导转移法是将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽(配体)形成复合物，可通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。 例如在体外通过质粒转移凝固因子基因于皮肤成纤维细胞中再植入体内治疗重度A型血友病。,脂质体介导转移法,传统上认为脂质体比病毒运载体有较少的免疫反应,但因转移效果不好，应用受到限制，有通过合成含有整合素基序和DNA结合结构域的多肽提高转移效果的报道。,微粒子轰击法,微粒子轰击法(microparticle bombardment) 利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，将它包裹起来形成微粒，通过物理途径(一般应用可调电压产生的轰击波)使它获得很高的速度即基因枪技术，微粒瞬间即可进入靶细胞，达到了转移基因的目的，而又不损伤靶细胞原有的结构。,聚乙烯亚胺介导转移法,聚乙烯亚胺(Polyethylenimine PEI)是线状或支链多阳离子聚合物和DNA形成复合物(PEI-DNA)，PEI-DNA已用于转移DNA到不同组织。 有报道在鼠囊性纤维化模型中，通过喷雾将PEI-DNA传送到肺组织中达到有效的治疗效果。,同源重组法,同源重组法(homologous recombination)是将外源性目的基因定位或原位修补，导入的外源基因和染色体上的基因在同源顺序间发生重组而插入染色体，这样外源基因不是随机地而是专一地整合到靶细胞的特定位点，取代原位点上的缺陷基因。,目的基因的表达,为了使目的基因良好表达，需在重组病毒上加上调控因子如启动子和增强子等，使整合入宿主的基因得到有效表达，产生所需的基因产物。,靶细胞选择,实现基因治疗要从患者体内取出细胞经体外培养、目的基因的转移，然后重新返回人体产生治疗效应。因此，选择靶细胞必须有一定条件，即： 易于取材，自体移植无排斥危险 易于培养和导入基因 移植时不会因细胞老化而影响基因表达 重新植入后，能高速血管化，便于释放外源基因编码的蛋白进入血管。,因此靶细胞选用应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。如ADA缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等都以骨髓细胞作为靶细胞。 除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞、皮肤成纤维细胞、外周血淋巴细胞、也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。,反义寡核苷酸技术,一些遗传病和肿瘤往往是基因突变或过量表达而产生异常的蛋白质所致，如果应用DNA和RNA的碱基互补，可形成同源和异源双链的原理，将这些突变基因转录的mRNA(DNA)阻断在翻译(或转录)前，使症状得到改善。即人为的制成反义核酸，使其和mRNA互补结合，阻止其翻译成蛋白质而达到治疗疾病的目的。目前常用的就是将人工合成的反义寡核苷酸导入细胞，使它识别并结合到靶mRNA上，从而使之灭活。,下列几种技术可达到治疗的目的： 反义RNA表达载体 反义RNA(或DNA)的体外微注射，即人工合成或通过噬菌体RNA聚合酶产生靶基因的反义RNA，通过微注射入细胞达到抑制靶基因mRNA的目的 用脂质体运送反义RNA，脂质体是由双磷脂膜包围的水相封闭的水泡，反义RNA即溶于其中然后注入体内 其他方法，如利用CaCl2法或细胞打孔仪、逆病毒载体等导入反义RNA或DNA。,安全性问题,安全性问题是基因治疗临床实验前首先要重视的问题。由于基因治疗尚未发展到定点整合以置换缺陷或有害基因的阶段，目的基因在基因组中随机整合